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2020版《赢在微点》高考生物人教版一轮复习讲义：第十一单元第01讲 基因工程
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第十一单元 现代生物科技专题
第01讲 基 因 工 程
最新考纲
高频考点
核心素养
1.基因工程的诞生(Ⅰ)
2．基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)
3．基因工程的应用(Ⅱ)
4．蛋白质工程(Ⅰ)
5．DNA的粗提取与鉴定
1.基因工程的工具与操作程序及应用
2．蛋白质工程的操作
生命观念——结构决定功能：基因的结构与功能
科学思维——建立模型：基因工程的操作流程
科学探究——解决问题：基因工程的应用和蛋白质工程
考点一 基因工程的基本工具及操作过程
1．基因工程的基本工具
(1)限制酶
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。
②类型
(3)载体
①常用载体——
②其他载体：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
③载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
2．基因工程的基本操作程序
(选修3 P6“寻根问底”改编)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。
答案 不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。 走出误区 误认为切取目的基因与切取载体时“只能”使用“同一种酶”
1．在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
2．为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端。
诊断辨析
(1)限制酶只能用于切割目的基因。(×)
(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(×)
(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。(×)
(4)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(×)
(5)限制酶也可以识别和切割RNA。(×)
(6)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。(×)
(7)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(×)
(8)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。(√)
(9)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(×)
(10)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。(×)
(11)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(√)
(12)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。(×)
(13)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。(√)
(14)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。(√)
(15)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。(×)
热图解读
图甲和图乙分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。请据图回答：
(1)EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点分别是什么？
(2)以上实例说明限制酶具有________。
(3)要将图乙中的末端再连接起来，需要________连接酶。
提示 (1)EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在C和G之间。
(2)专一性 (3)T4 DNA
考向一 基因工程操作的基本工具
1．如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③
C．①④②③ D．①④③②
解析 限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端，因此作用于①；DNA聚合酶用于DNA分子的复制，能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来，因此作用于④；DNA连接酶能在具有相同碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，因此作用于②；解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开，故作用于③。故选C。
答案 C
2．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图甲)，拟将其与质粒(图乙)重组，再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是 ( )
A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
解析 目的基因C和质粒都有可被EcoR Ⅰ切割的酶切位点，另外需要DNA连接酶将切好的目的基因和质粒连接起来，A项正确；愈伤组织全能性较高，是理想的植物受体细胞，将目的基因导入植物受体细胞的方法通常为农杆菌转化法，B项正确；质粒中含有潮霉素抗性基因，因此选择培养基中应该加入潮霉素，C项错误；使用分子杂交方法可检测目的基因是否整合到受体染色体上，D项正确。
答案 C
确定限制酶的种类
1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
2．根据质粒的特点确定限制酶的种类
(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
(2)质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
考向二 目的基因的获取及基因表达载体的构建
3.(2019·湖北七市一模)基因工程是从分子水平对基因进行操作，从而实现人们定向改造生物，得到人们所需要的生物性状或生物产品的技术。目的基因的获取是基因工程的第一步，常见的方法是构建基因组文库。请分析并回答下列问题：
(1)构建基因组文库的一般步骤：
①提取某种生物体内的________________________，用适当的限制酶处理，得到一定范围大小的DNA片段；
②DNA片段分别与载体结合，得到重组载体；
③将重组载体导入________的群体中储存，基因组文库构建完成。
(2)与基因组文库相比，cDNA文库的基因数相对要少。其原因是______________________________________________。
(3)载体与DNA片段结合前，需要使用同种的限制酶处理。其目的是________________________________________________。
(4)受体菌被导入重组DNA分子之前，常用________处理，提高导入的成功率。
解析 (1)构建基因组文库的一般步骤为①提取某种生物体内的全部DNA或全部基因，用适当的限制酶处理，得到一定范围大小的DNA片段；②DNA片段分别与载体结合，得到重组载体；③重组载体导入受体菌的群体中储存，基因组文库构建完成。(2)cDNA文库只能收集到生物发育到某时期已发生转录的基因，而基因组文库能收集到全部基因，因此与基因组文库相比，cDNA文库的基因数相对要少。(3)载体与DNA片段结合前，需要使用同种的限制酶处理，以获得与DNA片段相同的黏性末端。(4)将重组DNA导入受体菌群之前，常用钙离子处理，以提高导入的成功率。
答案 (1)全部DNA或全部基因 受体菌
(2)cDNA文库只能收集到生物发育到某时期已发生转录的基因，而基因组文库能收集到全部基因
(3)获得与DNA片段相同的黏性末端
(4)Ca2＋
1．几种目的基因获取方法的比较
(1)基因文库的分类：按外源DNA片段的来源分类
种类
(2)基因文库的构建方法
(3)构建基因文库的目的
为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。
2．基因表达载体中启动子、终止子的来源
(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子，因为目的基因中已含有启动子、终止子。
(2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。若只将基因的编码序列导入受体生物中，目的基因没有启动子、终止子，是无法转录的，因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
考向三 基因工程的操作程序
4．(2019·南昌一模)科学家提出，将蓝藻细胞中的ictB基因导入水稻细胞内，可以提高水稻的产量。请回答下列相关问题：
(1)基因工程最核心的步骤是__________________，这个过程需要________酶和________酶参与催化。
(2)若用农杆菌转化法将表达载体导入受体细胞，则必须将ictB基因插入农杆菌的________质粒的________内部，再将含有目的基因的农杆菌和水稻愈伤组织混合处理。
(3)要检测ictB基因是否成功导入水稻细胞，可以用________作为探针，使探针和提取出的转基因水稻基因组DNA杂交，如果出现________，表明目的基因已经成功导入水稻细胞。
(4)要确认高产水稻是否培育成功，必须要对培育出的水稻做什么检测？__________________________
__________________________。
解析 (1)基因表达载体的构建是基因工程最核心的步骤，这个过程需要限制酶和DNA连接酶参与催化。(2)若用农杆菌转化法将表达载体导入受体细胞，需将ictB基因插入农杆菌的Ti质粒的TDNA(可转移的DNA)内部。(3)用放射性同位素(或荧光物质)等标记的目的基因作为探针，使探针和提取出的转基因水稻基因组DNA杂交，可以检测ictB基因是否成功导入水稻细胞。如果出现杂交带，表明目的基因已经成功导入水稻细胞。(4)通过检测水稻的产量可进一步确认高产水稻是否培育成功。
答案 (1)基因表达载体的构建 限制 DNA连接
(2)Ti TDNA
(3)放射性同位素(或荧光物质)等标记的目的基因 杂交带
(4)检测水稻产量是否确实提高了(水稻是否增产)
5．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H. Boyer)和科恩(S. Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了
__________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用______________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
解析 (1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该过程证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋处理，目的是增大细胞的通透性，使重组的质粒能够导入受体细胞内，因此体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体DNA通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组噬菌体DNA导入受体细胞，噬菌体侵染的是细菌，而不能寄生在其他细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解，为防止蛋白质被降解，可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白酶活性的药物，因此为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。
答案 (1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达
(2)转化 外壳蛋白(噬菌体蛋白) 细菌
(3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
考点二 基因工程的应用及蛋白质工程
1．基因工程的应用
(1)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。
(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物(如抗虫棉)、抗病转基因植物(如转基因烟草)和抗逆转基因植物(如抗寒番茄)；利用转基因改良植物的品质(如新花色矮牵牛)。
2．基因诊断与基因治疗
(1)基因诊断：又称为DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。
(2)基因治疗
①概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。
②成果：将腺苷酸脱氨酸基因转入取自患者的淋巴细胞中，使淋巴细胞能产生腺苷酸脱氨酶，然后，再将这种淋巴细胞转入患者体内，从而治疗复合型免疫缺陷症。
3．蛋白质工程
(1)概念理解
(2)基本流程
诊断辨析
(1)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株。(√)
(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。(×)
(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。(×)
(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。(√)
(5)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。(×)
1．如图表示利用乳腺生物反应器生产某种动物蛋白的流程示意图，请分析回答下列问题。
(1)该生产流程中应用到的现代生物技术有________、________(写出其中两种)。
(2)图中A、B分别表示__________________________、__________________________。
(3)为提高培育成功率，进行②过程之前，对早期胚胎的处理是取其部分细胞用目的基因探针进行________________检测，对受体动物的处理是用________________进行同期发情处理。
(4)蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质，原因是______________________________。
解析 (1)据图分析，涉及的现代生物技术有蛋白质工程、基因工程、早期胚胎培养技术、胚胎移植技术等。(2)蛋白质工程基本途径：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)；基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。(3)胚胎移植之前，采用DNA分子杂交技术对早期胚胎进行基因检测或基因诊断，可提高培育成功率。为提高胚胎移植成功率，该过程可用促性腺激素对受体动物进行同期发情处理。(4)蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质，原因是改造后的基因能够遗传，且改造基因易于操作。
答案 (1)蛋白质工程 基因工程(胚胎移植技术)(任写两种)
(2)推测应有的氨基酸序列 基因表达载体
(3)DNA(核酸)分子杂交 促性腺激素
(4)改造后的基因能够遗传，改造基因易于操作
2．基因疗法所涉及的基因工程技术主要有三种，包括病毒载体、基因(编辑)和细胞改造。请回答：
(1)第一种是将________通过载体送入目标细胞让其发挥作用。该技术用来传递基因的载体多是病毒类载体，因为它们能______________________。经过基因改造后，这些作为载体的病毒具有______________________________的特点。
(2)第二种是直接通过基因(编辑)技术修复目标细胞的________。基因(编辑)技术可以达到添加基因、消除基因或者________的效果。
(3)第三种则是从患者体内提取细胞在体外进行修改然后再重新输回患者体内发挥作用。例如，对造血干细胞进行基因工程改造让其制造内源性的凝血因子，从理论上说能持续缓解血友病症状，而不需使用________治疗。基因治疗进入了一个兼具安全性和有效性的时代。但你认为这个领域中的问题是____________________________________。
解析 (1)将目的基因通过载体送入目标细胞让其发挥作用是基因工程中最常用的技术手段，该技术常用病毒类载体传递基因，主要是因为某些病毒能将基因整合进宿主细胞的DNA分子，这些作为载体的病毒和转入的目的基因对宿主细胞无毒性。(2)直接通过基因(编辑)技术修复目标细胞的缺陷基因，可以达到添加基因、消除基因或者矫正缺陷基因的效果，这是我们常用的基因治疗技术。(3)对造血干细胞进行基因工程改造让其制造内源性的凝血因子，从理论上说能持续缓解血友病症状，而不需输凝血酶或输血小板或输凝血因子治疗。在目前阶段，基因治疗这个领域中关键需要考虑的是载体的遗传毒性、基因编辑的脱靶效应、基因递送和编辑的效率低或者有临床益处的水平低等问题。
答案 (1)目的基因 将基因整合进宿主的DNA分子 将目的基因转移到宿主细胞中且无毒性(或载体无法增殖或无感染性)
(2)缺陷基因 矫正缺陷基因
(3)输凝血酶(或输血小板或输凝血因子) 载体的遗传毒性(或者基因编辑的脱靶效应或者基因递送和编辑的效率低或者有临床益处的水平低)
考点三 PCR技术与DNA粗提取与鉴定
1．RCR技术
(1)原理：DNA双链复制。
(2)条件
(3)过程
2．DNA的粗提取与鉴定
(1)实验原理
(2)操作流程
考向一 PCR技术
1．(2019·广州调研)如图为利用PCR技术检测受检人是否携带HIV(属逆转录病毒)的示意图。请回答：
(1)组成HIV的遗传物质的单体是________。HIV携带者T细胞的核DNA能指导合成HIV的蛋白质，原因是______________________。
(2)设计图中所示的引物时，应满足以下要求：
①引物自身不能存在互补配对序列，原因是避免引物自身通过折叠形成双链区；
②引物之间不能存在________，原因是避免两引物结合成双链；
③______________________________。
(3)在PCR反应体系中，除具备缓冲液、模板DNA分子和引物外，还应有________(填序号)。
①Taq酶 ②dNTP(dCTP、dATP、dGTP和dTTP) ③四种碱基 ④ATP ⑤氨基酸
(4)利用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时，需使用DNA连接酶来构建基因表达载体。常用DNA连接酶中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________DNA连接酶，DNA连接酶催化形成的化学键是________。基因表达载体必须有RNA聚合酶识别和结合的部位，该部位称为________。
解析 (1)HIV属于RNA病毒，其遗传物质是RNA，RNA的基本组成单位是核糖核苷酸；T细胞的核DNA能指导合成HIV的蛋白质，说明T细胞的DNA中整合了HIV的RNA逆转录出的DNA，并且能够发生正常的转录、翻译。(2)为避免两引物结合成双链，两引物之间不能存在碱基互补配对序列；且引物只能和HIV的RNA逆转录出的DNA进行序列互补配对。(3)PCR反应体系中要包含模板DNA、dNTP(包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)和扩增缓冲液。(4)DNA连接酶常见的有E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶；DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键；RNA聚合酶识别和结合的部位是启动子。
答案 (1)核糖核苷酸 HIV的RNA逆转录出的DNA能整合到T细胞的核DNA中，且能被正常转录和翻译(合理即可)
(2)②互补配对序列 ③引物只能和HIV的RNA逆转录出的DNA进行序列互补配对
(3)①②
(4)T4 磷酸二酯键 启动子
考向二 DNA的粗提取与鉴定
2.实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
(1)根据下图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？
__________________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是____________，同时说明DNA对高温有较强的________。
(4)A试管在实验中的作用是__________________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与__________________________________有关。
解析 A、B两试管形成对照，B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
答案 (1)溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色
(2)溶液颜色基本不变
(3)加快颜色反应速度 耐受性
(4)对照
(5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
1．(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中的基因表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________，使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光的细胞的________移入牛的__________中，体外培养，胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
解析 (1)要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端而获得的L1－GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶，是E1和E4。(2)构建的真核表达载体P1中含有GFP基因，而GFP基因的表达产物“某种荧光蛋白(GFP)”在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达。基因的表达过程包括转录和翻译。(3)若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。(4)PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
答案 (1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接
(2)转录 翻译 (3)细胞核 去核卵母细胞
(4)核DNA
2．(2018·江苏高考)为生产具有特定性能的α淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α淀粉酶，实验流程如图。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增α淀粉酶基因前，需先获得细菌的________。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的________端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是________________________。
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中________的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间
⑤退火时间 ⑥延伸时间
(4)如图表示筛选获得的工程菌中编码α淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA片段包含________个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。
(5)获得工程菌表达的α淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如表所示：
根据上述实验结果，初步判断该α淀粉酶活性最高的条件为__________________________。
解析 (1)利用PCR技术扩增α淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA。(2)构建重组DNA分子时，需用限制性核酸内切酶处理目的基因和载体，故需要在引物的5′端添加限制性酶识别序列，且常在两条引物上设计添加不同的限制性酶切位点，这样可以使DNA片段按照一定方向插入表达载体，防止目的基因或载体自身的黏性末端之间相互连接以及目的基因与载体反向连接。(3)利用PCR技术进行扩增时，退火温度的设定是成败的关键，退火温度过高会使引物无法与模板的碱基配对，所以退火温度的设定与引物有关；延伸时间的设定与扩增片段的长度有关。(4)密码子由mRNA上相邻的3个碱基组成，所以该片段的24个碱基包含8个密码子。该片段后面的第一个碱基为U，所以后面的密码子最多可能有4×4＝16(种)，根据题干信息及题中给出的mRNA序列可知，虚线框后第一个密码子不可能是终止密码子，所以实际最多有13种密码子。(5)由表格数据可知，该α淀粉酶活性最高的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris－HCl。
答案 (1)基因组DNA
(2)5′ 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连
(3)② ⑥ (4)8 13
(5)pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris－HCl
第十一单元 现代生物科技专题
第01讲 基 因 工 程
最新考纲
高频考点
核心素养
1.基因工程的诞生(Ⅰ)
2．基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)
3．基因工程的应用(Ⅱ)
4．蛋白质工程(Ⅰ)
5．DNA的粗提取与鉴定
1.基因工程的工具与操作程序及应用
2．蛋白质工程的操作
生命观念——结构决定功能：基因的结构与功能
科学思维——建立模型：基因工程的操作流程
科学探究——解决问题：基因工程的应用和蛋白质工程
考点一 基因工程的基本工具及操作过程
1．基因工程的基本工具
(1)限制酶
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。
②类型
(3)载体
①常用载体——
②其他载体：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
③载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
2．基因工程的基本操作程序
(选修3 P6“寻根问底”改编)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。
答案 不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。 走出误区 误认为切取目的基因与切取载体时“只能”使用“同一种酶”
1．在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
2．为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端。
诊断辨析
(1)限制酶只能用于切割目的基因。(×)
(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(×)
(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。(×)
(4)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(×)
(5)限制酶也可以识别和切割RNA。(×)
(6)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。(×)
(7)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(×)
(8)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。(√)
(9)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(×)
(10)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。(×)
(11)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(√)
(12)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。(×)
(13)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。(√)
(14)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。(√)
(15)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。(×)
热图解读
图甲和图乙分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。请据图回答：
(1)EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点分别是什么？
(2)以上实例说明限制酶具有________。
(3)要将图乙中的末端再连接起来，需要________连接酶。
提示 (1)EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在C和G之间。
(2)专一性 (3)T4 DNA
考向一 基因工程操作的基本工具
1．如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③
C．①④②③ D．①④③②
解析 限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端，因此作用于①；DNA聚合酶用于DNA分子的复制，能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来，因此作用于④；DNA连接酶能在具有相同碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，因此作用于②；解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开，故作用于③。故选C。
答案 C
2．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图甲)，拟将其与质粒(图乙)重组，再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是 ( )
A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
解析 目的基因C和质粒都有可被EcoR Ⅰ切割的酶切位点，另外需要DNA连接酶将切好的目的基因和质粒连接起来，A项正确；愈伤组织全能性较高，是理想的植物受体细胞，将目的基因导入植物受体细胞的方法通常为农杆菌转化法，B项正确；质粒中含有潮霉素抗性基因，因此选择培养基中应该加入潮霉素，C项错误；使用分子杂交方法可检测目的基因是否整合到受体染色体上，D项正确。
答案 C
确定限制酶的种类
1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
2．根据质粒的特点确定限制酶的种类
(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
(2)质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
考向二 目的基因的获取及基因表达载体的构建
3.(2019·湖北七市一模)基因工程是从分子水平对基因进行操作，从而实现人们定向改造生物，得到人们所需要的生物性状或生物产品的技术。目的基因的获取是基因工程的第一步，常见的方法是构建基因组文库。请分析并回答下列问题：
(1)构建基因组文库的一般步骤：
①提取某种生物体内的________________________，用适当的限制酶处理，得到一定范围大小的DNA片段；
②DNA片段分别与载体结合，得到重组载体；
③将重组载体导入________的群体中储存，基因组文库构建完成。
(2)与基因组文库相比，cDNA文库的基因数相对要少。其原因是______________________________________________。
(3)载体与DNA片段结合前，需要使用同种的限制酶处理。其目的是________________________________________________。
(4)受体菌被导入重组DNA分子之前，常用________处理，提高导入的成功率。
解析 (1)构建基因组文库的一般步骤为①提取某种生物体内的全部DNA或全部基因，用适当的限制酶处理，得到一定范围大小的DNA片段；②DNA片段分别与载体结合，得到重组载体；③重组载体导入受体菌的群体中储存，基因组文库构建完成。(2)cDNA文库只能收集到生物发育到某时期已发生转录的基因，而基因组文库能收集到全部基因，因此与基因组文库相比，cDNA文库的基因数相对要少。(3)载体与DNA片段结合前，需要使用同种的限制酶处理，以获得与DNA片段相同的黏性末端。(4)将重组DNA导入受体菌群之前，常用钙离子处理，以提高导入的成功率。
答案 (1)全部DNA或全部基因 受体菌
(2)cDNA文库只能收集到生物发育到某时期已发生转录的基因，而基因组文库能收集到全部基因
(3)获得与DNA片段相同的黏性末端
(4)Ca2＋
1．几种目的基因获取方法的比较
(1)基因文库的分类：按外源DNA片段的来源分类
种类
(2)基因文库的构建方法
(3)构建基因文库的目的
为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。
2．基因表达载体中启动子、终止子的来源
(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子，因为目的基因中已含有启动子、终止子。
(2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。若只将基因的编码序列导入受体生物中，目的基因没有启动子、终止子，是无法转录的，因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
考向三 基因工程的操作程序
4．(2019·南昌一模)科学家提出，将蓝藻细胞中的ictB基因导入水稻细胞内，可以提高水稻的产量。请回答下列相关问题：
(1)基因工程最核心的步骤是__________________，这个过程需要________酶和________酶参与催化。
(2)若用农杆菌转化法将表达载体导入受体细胞，则必须将ictB基因插入农杆菌的________质粒的________内部，再将含有目的基因的农杆菌和水稻愈伤组织混合处理。
(3)要检测ictB基因是否成功导入水稻细胞，可以用________作为探针，使探针和提取出的转基因水稻基因组DNA杂交，如果出现________，表明目的基因已经成功导入水稻细胞。
(4)要确认高产水稻是否培育成功，必须要对培育出的水稻做什么检测？__________________________
__________________________。
解析 (1)基因表达载体的构建是基因工程最核心的步骤，这个过程需要限制酶和DNA连接酶参与催化。(2)若用农杆菌转化法将表达载体导入受体细胞，需将ictB基因插入农杆菌的Ti质粒的TDNA(可转移的DNA)内部。(3)用放射性同位素(或荧光物质)等标记的目的基因作为探针，使探针和提取出的转基因水稻基因组DNA杂交，可以检测ictB基因是否成功导入水稻细胞。如果出现杂交带，表明目的基因已经成功导入水稻细胞。(4)通过检测水稻的产量可进一步确认高产水稻是否培育成功。
答案 (1)基因表达载体的构建 限制 DNA连接
(2)Ti TDNA
(3)放射性同位素(或荧光物质)等标记的目的基因 杂交带
(4)检测水稻产量是否确实提高了(水稻是否增产)
5．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H. Boyer)和科恩(S. Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了
__________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用______________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
解析 (1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该过程证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋处理，目的是增大细胞的通透性，使重组的质粒能够导入受体细胞内，因此体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体DNA通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组噬菌体DNA导入受体细胞，噬菌体侵染的是细菌，而不能寄生在其他细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解，为防止蛋白质被降解，可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白酶活性的药物，因此为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。
答案 (1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达
(2)转化 外壳蛋白(噬菌体蛋白) 细菌
(3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
考点二 基因工程的应用及蛋白质工程
1．基因工程的应用
(1)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。
(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物(如抗虫棉)、抗病转基因植物(如转基因烟草)和抗逆转基因植物(如抗寒番茄)；利用转基因改良植物的品质(如新花色矮牵牛)。
2．基因诊断与基因治疗
(1)基因诊断：又称为DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。
(2)基因治疗
①概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。
②成果：将腺苷酸脱氨酸基因转入取自患者的淋巴细胞中，使淋巴细胞能产生腺苷酸脱氨酶，然后，再将这种淋巴细胞转入患者体内，从而治疗复合型免疫缺陷症。
3．蛋白质工程
(1)概念理解
(2)基本流程
诊断辨析
(1)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株。(√)
(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。(×)
(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。(×)
(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。(√)
(5)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。(×)
1．如图表示利用乳腺生物反应器生产某种动物蛋白的流程示意图，请分析回答下列问题。
(1)该生产流程中应用到的现代生物技术有________、________(写出其中两种)。
(2)图中A、B分别表示__________________________、__________________________。
(3)为提高培育成功率，进行②过程之前，对早期胚胎的处理是取其部分细胞用目的基因探针进行________________检测，对受体动物的处理是用________________进行同期发情处理。
(4)蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质，原因是______________________________。
解析 (1)据图分析，涉及的现代生物技术有蛋白质工程、基因工程、早期胚胎培养技术、胚胎移植技术等。(2)蛋白质工程基本途径：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)；基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。(3)胚胎移植之前，采用DNA分子杂交技术对早期胚胎进行基因检测或基因诊断，可提高培育成功率。为提高胚胎移植成功率，该过程可用促性腺激素对受体动物进行同期发情处理。(4)蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质，原因是改造后的基因能够遗传，且改造基因易于操作。
答案 (1)蛋白质工程 基因工程(胚胎移植技术)(任写两种)
(2)推测应有的氨基酸序列 基因表达载体
(3)DNA(核酸)分子杂交 促性腺激素
(4)改造后的基因能够遗传，改造基因易于操作
2．基因疗法所涉及的基因工程技术主要有三种，包括病毒载体、基因(编辑)和细胞改造。请回答：
(1)第一种是将________通过载体送入目标细胞让其发挥作用。该技术用来传递基因的载体多是病毒类载体，因为它们能______________________。经过基因改造后，这些作为载体的病毒具有______________________________的特点。
(2)第二种是直接通过基因(编辑)技术修复目标细胞的________。基因(编辑)技术可以达到添加基因、消除基因或者________的效果。
(3)第三种则是从患者体内提取细胞在体外进行修改然后再重新输回患者体内发挥作用。例如，对造血干细胞进行基因工程改造让其制造内源性的凝血因子，从理论上说能持续缓解血友病症状，而不需使用________治疗。基因治疗进入了一个兼具安全性和有效性的时代。但你认为这个领域中的问题是____________________________________。
解析 (1)将目的基因通过载体送入目标细胞让其发挥作用是基因工程中最常用的技术手段，该技术常用病毒类载体传递基因，主要是因为某些病毒能将基因整合进宿主细胞的DNA分子，这些作为载体的病毒和转入的目的基因对宿主细胞无毒性。(2)直接通过基因(编辑)技术修复目标细胞的缺陷基因，可以达到添加基因、消除基因或者矫正缺陷基因的效果，这是我们常用的基因治疗技术。(3)对造血干细胞进行基因工程改造让其制造内源性的凝血因子，从理论上说能持续缓解血友病症状，而不需输凝血酶或输血小板或输凝血因子治疗。在目前阶段，基因治疗这个领域中关键需要考虑的是载体的遗传毒性、基因编辑的脱靶效应、基因递送和编辑的效率低或者有临床益处的水平低等问题。
答案 (1)目的基因 将基因整合进宿主的DNA分子 将目的基因转移到宿主细胞中且无毒性(或载体无法增殖或无感染性)
(2)缺陷基因 矫正缺陷基因
(3)输凝血酶(或输血小板或输凝血因子) 载体的遗传毒性(或者基因编辑的脱靶效应或者基因递送和编辑的效率低或者有临床益处的水平低)
考点三 PCR技术与DNA粗提取与鉴定
1．RCR技术
(1)原理：DNA双链复制。
(2)条件
(3)过程
2．DNA的粗提取与鉴定
(1)实验原理
(2)操作流程
考向一 PCR技术
1．(2019·广州调研)如图为利用PCR技术检测受检人是否携带HIV(属逆转录病毒)的示意图。请回答：
(1)组成HIV的遗传物质的单体是________。HIV携带者T细胞的核DNA能指导合成HIV的蛋白质，原因是______________________。
(2)设计图中所示的引物时，应满足以下要求：
①引物自身不能存在互补配对序列，原因是避免引物自身通过折叠形成双链区；
②引物之间不能存在________，原因是避免两引物结合成双链；
③______________________________。
(3)在PCR反应体系中，除具备缓冲液、模板DNA分子和引物外，还应有________(填序号)。
①Taq酶 ②dNTP(dCTP、dATP、dGTP和dTTP) ③四种碱基 ④ATP ⑤氨基酸
(4)利用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时，需使用DNA连接酶来构建基因表达载体。常用DNA连接酶中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________DNA连接酶，DNA连接酶催化形成的化学键是________。基因表达载体必须有RNA聚合酶识别和结合的部位，该部位称为________。
解析 (1)HIV属于RNA病毒，其遗传物质是RNA，RNA的基本组成单位是核糖核苷酸；T细胞的核DNA能指导合成HIV的蛋白质，说明T细胞的DNA中整合了HIV的RNA逆转录出的DNA，并且能够发生正常的转录、翻译。(2)为避免两引物结合成双链，两引物之间不能存在碱基互补配对序列；且引物只能和HIV的RNA逆转录出的DNA进行序列互补配对。(3)PCR反应体系中要包含模板DNA、dNTP(包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)和扩增缓冲液。(4)DNA连接酶常见的有E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶；DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键；RNA聚合酶识别和结合的部位是启动子。
答案 (1)核糖核苷酸 HIV的RNA逆转录出的DNA能整合到T细胞的核DNA中，且能被正常转录和翻译(合理即可)
(2)②互补配对序列 ③引物只能和HIV的RNA逆转录出的DNA进行序列互补配对
(3)①②
(4)T4 磷酸二酯键 启动子
考向二 DNA的粗提取与鉴定
2.实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
(1)根据下图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？
__________________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是____________，同时说明DNA对高温有较强的________。
(4)A试管在实验中的作用是__________________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与__________________________________有关。
解析 A、B两试管形成对照，B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
答案 (1)溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色
(2)溶液颜色基本不变
(3)加快颜色反应速度 耐受性
(4)对照
(5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
1．(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中的基因表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________，使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光的细胞的________移入牛的__________中，体外培养，胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
解析 (1)要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端而获得的L1－GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶，是E1和E4。(2)构建的真核表达载体P1中含有GFP基因，而GFP基因的表达产物“某种荧光蛋白(GFP)”在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达。基因的表达过程包括转录和翻译。(3)若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。(4)PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
答案 (1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接
(2)转录 翻译 (3)细胞核 去核卵母细胞
(4)核DNA
2．(2018·江苏高考)为生产具有特定性能的α淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α淀粉酶，实验流程如图。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增α淀粉酶基因前，需先获得细菌的________。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的________端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是________________________。
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中________的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间
⑤退火时间 ⑥延伸时间
(4)如图表示筛选获得的工程菌中编码α淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA片段包含________个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。
(5)获得工程菌表达的α淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如表所示：
根据上述实验结果，初步判断该α淀粉酶活性最高的条件为__________________________。
解析 (1)利用PCR技术扩增α淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA。(2)构建重组DNA分子时，需用限制性核酸内切酶处理目的基因和载体，故需要在引物的5′端添加限制性酶识别序列，且常在两条引物上设计添加不同的限制性酶切位点，这样可以使DNA片段按照一定方向插入表达载体，防止目的基因或载体自身的黏性末端之间相互连接以及目的基因与载体反向连接。(3)利用PCR技术进行扩增时，退火温度的设定是成败的关键，退火温度过高会使引物无法与模板的碱基配对，所以退火温度的设定与引物有关；延伸时间的设定与扩增片段的长度有关。(4)密码子由mRNA上相邻的3个碱基组成，所以该片段的24个碱基包含8个密码子。该片段后面的第一个碱基为U，所以后面的密码子最多可能有4×4＝16(种)，根据题干信息及题中给出的mRNA序列可知，虚线框后第一个密码子不可能是终止密码子，所以实际最多有13种密码子。(5)由表格数据可知，该α淀粉酶活性最高的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris－HCl。
答案 (1)基因组DNA
(2)5′ 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连
(3)② ⑥ (4)8 13
(5)pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris－HCl
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