2020浙江高考生物二轮讲义：第20讲　基因工程和克隆技术

第20讲　基因工程和克隆技术

　基因工程

1．基因工程的操作工具

(1)与DNA有关的四种酶

(2)限制酶

①识别序列的特点：呈现碱基互补对称。无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如，以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。

②切割后末端的种类

③限制酶的选择技巧

a．根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类

Ⅰ.应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

Ⅱ.不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

Ⅲ.为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。

b．根据质粒的特点确定限制酶的种类

Ⅰ.所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的粘性末端。

Ⅱ.质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

(3)限制酶和DNA连接酶的关系

①限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。

②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

③DNA连接酶起作用时，不需要模板。

(4)载体

①条件与目的

②作用

a．作为运载工具，将目的基因导入宿主细胞内。

b．利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。

2．基因工程的基本操作程序和应用

(1)获取目的基因的3种途径

①从基因文库中获取。

②PCR技术扩增。

③化学方法人工合成。

(2)基因表达载体的组成

目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因＋复制原点。

(3)目的基因导入受体细胞的方法

①导入植物细胞

a．农杆菌转化法；b.基因枪法；c.花粉管通道法。

②导入动物细胞：显微注射法。

③导入微生物细胞：Ca2＋处理法(感受态细胞法)。

(4)目的基因的检测与鉴定的方法

①检测目的基因是否导入受体细胞：DNA分子杂交法。

②检测目的基因是否转录出mRNA：分子杂交技术。

③检测目的基因是否翻译出蛋白质：抗原—抗体杂交技术。

④个体生物学水平鉴定：根据表达性状判断。

3．基因工程的常考点

(1)目的基因插入位置：启动子与终止子之间。

(2)将目的基因导入受体细胞没有碱基互补配对现象。

(3)常用的受体细胞

①植物：受精卵、体细胞。

②动物：受精卵。

③微生物：大肠杆菌、酵母菌等。

(4)原核生物作为受体细胞的优点：多为单细胞、繁殖快、遗传物质相对较少。

　某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：

(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_____________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。

(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是___________________________________；并且____________和______________的细胞也是不能区分的，其原因是___________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。

(3)基因工程中，某些噬菌体经过改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自________。

[解析]　(1)作为运载体的质粒上应有一个至多个限制酶切割位点，在细胞中能够自我复制，且含有特殊的标记基因。(2)未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌中均未导入质粒载体，而质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此这样的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的培养基中不能生长。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，二者在含有氨苄青霉素的培养基中都能生长，因此无法区分二者。根据题图，用BamH Ⅰ切割质粒后将四环素抗性基因破坏，因此可将经氨苄青霉素培养基筛选出的菌落置于含有四环素的培养基上再次筛选，能在含四环素培养基上生存的是含有质粒载体的大肠杆菌，不能生存的是含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。(3)噬菌体为病毒，经改造后作为载体时，其DNA复制所需原料来自受体细胞。

[答案]　(1)能自我复制、具有标记基因　(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素　(3)受体细胞

基因工程操作过程中的几个易错点

(1)目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。

(2)使用限制酶的注意点

①一般用同一种限制酶切割载体和获取目的基因。

②不同的限制酶也能切割出相同的粘性末端。

(3)受体细胞的选择：受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。要合成粘连蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，也没有核糖体等细胞器，不能合成蛋白质。

(4)还应注意的问题

①基因表达载体中，启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。

②基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。　

[题组突破]

1．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是(　　)

A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒

B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞

C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞

D．用分子杂交技术检测C基因是否整合到菊花染色体上

解析：选C。在形成重组DNA分子时，为保证目的基因与载体的连接，需要用同种限制性核酸内切酶进行切割产生相同的粘性末端，才能通过DNA连接酶连接，图中目的基因的两端和启动子与终止子之间都有限制性核酸内切酶EcoRⅠ的切割位点，因此选用限制性核酸内切酶EcoRⅠ切割目的基因和载体，A正确；菊花为双子叶植物，将目的基因导入双子叶植物细胞的常用方法是农杆菌转化法，B正确；图2中重组质粒中的抗性基因为潮霉素抗性基因，应该在培养基中添加潮霉素，筛选被转化的菊花细胞，C错误；要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，常用DNA分子杂交技术，D正确。

2．兔肝细胞中的基因E编码代谢甲醛的酶，拟利用基因工程技术将基因E转入矮牵牛中，以提高矮牵牛对甲醛的代谢能力。请回答下列问题：

(1)从兔肝细胞中提取mRNA，在______酶的作用下形成互补的DNA，然后以此DNA为模板扩增得到基因E。在相关酶的作用下，将基因E与Ti质粒连接在一起，形成________________，再导入用氯化钙处理的________，侵染矮牵牛叶片。将被浸染的叶片除菌后进行培养，最终得到转基因矮牵牛。其中培养过程正确的是________________________________________________________________________

(A.叶片在含合适浓度生长素的培养基上分化形成愈伤组织　B．愈伤组织在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽　C．再生的芽在细胞分裂素含量高的培养基上生根　D．愈伤组织在含合适浓度植物生长调节剂的培养基上脱分化形成再生植株)。

(2)取转基因矮牵牛叶片，放入含MS液体培养基和适量浓度甲醛且密封的试管中。将试管置于__________上，进行液体悬浮培养。一段时间后测定培养基中甲醛的含量，以判断基因E是否在转基因矮牵牛中正常表达。培养过程中液体培养基的作用：一是提供营养；二是____________，从而使叶片保持正常的形态。

解析：(1)以mRNA为模板合成DNA的过程为逆转录过程，这一过程需要在逆转录酶的催化下进行。获得目的基因后，需在限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用下，将目的基因与运载体(Ti质粒)连接形成重组质粒(重组DNA分子)，再将其导入受体细胞。将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，先将重组DNA分子导入经氯化钙处理的农杆菌，再用导入目的基因的农杆菌侵染植物细胞，最终实现将目的基因导入植物细胞内。导入目的基因的植物细胞经组织培养过程形成转基因植物。组织培养过程中，叶片在含适宜浓度的生长素的培养基上脱分化形成愈伤组织，然后在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽，继而在生长素含量高的培养基上生根，最后形成完整的植株，愈伤组织形成植株的过程中发生细胞的再分化。

(2)植物组织培养过程中，将愈伤组织等细胞置于摇床上，进行液体悬浮培养，形成多个分散的细胞。培养过程中培养液一方面为植物细胞提供营养，另一方面维持一定的渗透压，从而使叶片保持正常的形态。

答案：(1)逆转录　重组DNA分子　农杆菌　B

(2) 摇床　维持渗透压

　克隆技术

1．植物组织培养与植物体细胞杂交

(1)植物组织培养与植物体细胞杂交的区别与联系

(2)单倍体育种和突变体的利用的不同点

(3)杂种植株染色体组成及基因型分析方法

①杂种植株的特征：具备两种植物的遗传特征。原因是杂种植株中含有两种植物的遗传物质。

②杂种植株的染色体组成和基因型

a．分析方法：体细胞杂交即两个细胞融合成一个细胞，不管染色体、基因组还是染色体组都采用直接相加的方法。

b．实例：若一植物细胞含有2X条染色体，2个染色体组，基因型为Aabb，另一植物细胞含有2Y条染色体，2个染色体组，基因型为ccDd，则新植株应为四倍体，其体细胞中染色体数为2X＋2Y，基因型为AabbccDd。

2．动物细胞融合和单克隆抗体

(1)植物体细胞杂交与动物细胞融合的不同点

(2)单克隆抗体的制备过程

　回答与植物克隆和动物克隆有关的问题：

(1)利用植物愈伤组织获得再生植株主要有两条途径：一是由愈伤组织的细胞先分化产生芽和根后再形成一个完整植株的________途径。二是由愈伤组织的细胞产生胚状体后再萌发形成完整植株的胚胎发生途径。另外也可不通过愈伤组织阶段而直接采用带腋芽的茎段培养成丛状苗，再诱导生根获得再生植株，其原因是腋芽中存在________。

(2)利用植物克隆培育新品种，一方面可利用带有目的基因的________侵染植株，或将目的基因通过________的方法导入植物细胞、组织或器官获得转基因植株。另一方面利用异源植物的________进行融合产生杂种植株，或利用异源植物在试管内进行________，对其产生的胚进行培养产生杂种植株。

(3)下列属于植物克隆和动物克隆共有的培养方法是________(A.悬浮培养、器官培养　B．贴壁培养、传代培养

C．器官培养、愈伤组织培养　D．原生质体培养、传代培养)。

[答案]　(1)器官发生　分生组织

(2)农杆菌　显微注射　原生质体　受精

(3)A

植物体细胞杂交和动物细胞融合过程

中所选酶和结果的辨析

(1)植物体细胞杂交与动物细胞融合中酶的作用对象不同，纤维素酶和果胶酶作用于细胞壁，而胰蛋白酶作用于细胞间的蛋白质。

(2)植物杂交细胞在激素诱导下能表达出全能性，但动物杂交细胞的全能性不能表达。　

[题组突破]

考向一　考查植物细胞工程

1．(2019·高考北京卷)甲、乙是严重危害某二倍体观赏植物的病害。研究者先分别获得抗甲、乙的转基因植株，再将二者杂交后得到F1，结合单倍体育种技术，培育出同时抗甲、乙的植物新品种。以下对相关操作及结果的叙述，错误的是(　　)

A．将含有目的基因和标记基因的载体导入受体细胞

B．通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定

C．调整培养基中植物激素比例获得F1 花粉再生植株

D．经花粉离体培养获得的若干再生植株均为二倍体

解析：选D。基因工程的核心是基因表达载体的构建，基因表达载体包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等，A项正确；可通过病原体接种实验对转基因植株进行个体水平的检测，B项正确；花粉离体培养技术就是以花粉为外植体进行的组培，其培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，且在组培不同阶段需要调整激素的比例，C项正确；抗甲、乙的植物新品种杂交后得到的F1仍为二倍体植物，所以F1经花粉离体培养获得的再生植株均为单倍体，D项错误。

2．某小组欲进行烟草原生质体分离与培养的研究。请回答：

(1)原生质体的分离：在无菌条件下，取烟草无菌苗的叶片，放入含有0.5 mol/L甘露醇(维持较高渗透压)的______________混合液处理，经过离心纯化后获得原生质体。

(2)原生质体的培养：将原生质体进行培养，重新长出细胞壁，形成胚性细胞。此时，应该________培养基中甘露醇的浓度，以利于胚性细胞继续培养形成细胞团，然后经两条途径形成再生植株。途径一：细胞团经球形胚、________和胚状体，最后发育成植株。途径二：细胞团增殖为愈伤组织，然后在发芽培养基上诱导出芽，切割芽经过生根后形成完整植株。上述发芽培养基中含量相对较高的激素是________，胚性细胞的主要特点是________(A.液泡小、细胞核小　B．液泡大、细胞核大　C．液泡大、细胞核小　D．液泡小、细胞核大)。

(3)为了对烟草的某些性状进行改良，分离得到两种烟草的原生质体后，通过________方法将它们的遗传物质组合在一起，经培养获得具有新性状的再生植株。提取再生植株的DNA，采用________扩增相关基因，来鉴定遗传物质是否成功重组。

答案：(1)果胶酶、纤维素酶　(2)降低　心形胚　细胞分裂素　D　(3)原生质体融合　PCR方法

考向二　动物细胞工程

3．(2019·高考江苏卷改编)下图为杂交瘤细胞制备示意图。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT－)，在HAT筛选培养液中不能正常合成DNA，无法生长。下列叙述错误的是(　　)

A．可用灭活的仙台病毒诱导细胞融合

B．两两融合的细胞都能在HAT培养液中生长

C．杂交瘤细胞需进一步筛选才能用于生产

D．细胞膜的流动性是细胞融合的基础

解析：选B。诱导动物细胞融合的方法有电激、聚乙二醇、灭活的病毒(如灭活的仙台病毒)等，A正确；两两融合的细胞包括免疫B细胞与免疫B细胞融合的具有同种核的细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合的具有同种核的细胞、免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞，骨髓瘤细胞虽然能无限增殖，但缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，免疫B细胞虽然有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，但不具有无限增殖的本领，所以在HAT筛选培养液中，两两融合的具有同种核的细胞都无法生长，只有杂交瘤细胞才能生长，B错误；因每个免疫B细胞只分泌一种特异性抗体，因此在HAT筛选培养液中筛选出来的众多的杂交瘤细胞所分泌的抗体，不一定都是人类所需要的，还需要进一步把能分泌人类所需要抗体的杂交瘤细胞筛选出来，C正确；动物细胞融合是以细胞膜的流动性为基础的，D正确。

4．下图是利用人成纤维细胞(具有分裂能力，能在HAT培养基上存活)和小鼠骨髓瘤细胞(具有分裂能力，不能在HAT培养基上存活)进行人类基因定位的操作示意图。请回答下列问题：

(1)该技术的基础是________________技术。

(2)操作所用的成纤维细胞应在________代以内；诱导融合所运用的生物学原理是______________________。该过程中，区别于植物原生质体融合的方法是运用________处理。

(3)HAT培养基属于________培养基；该培养基内需要加入________等天然物质。

(4)培养时，pH一般为________；操作过程中，加入乌本苷的目的是________________________________________________________________________。

答案：(1)动物细胞培养　(2)10　细胞膜具有一定的流动性　灭活病毒　(3)选择　血浆(血清)　(4)7.2～7.4　除去成纤维细胞

课后作业

一、选择题

1．(2019·杭州模拟)科学家利用生物技术将人的生长激素基因导入小鼠受精卵的细胞核中，经培育获得一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中，在医学研究及相关疾病的治疗方面都具有重要意义。下列有关叙述错误的是(　　)

A．选择受精卵作为外源基因的受体细胞是因为这种细胞具有全能性

B．采用DNA分子杂交技术可检测外源基因在小鼠细胞内是否成功表达

C．人的生长激素基因能在小鼠细胞内表达，说明遗传密码在不同种生物中可以通用

D．将转基因小鼠体细胞进行核移植(克隆)，可以获得多个具有外源基因的后代

解析：选B。选择受精卵作为外源基因的受体细胞是因为这种细胞具有全能性，而且全能性最高，A正确；采用DNA分子杂交技术可检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，但不能检测外源基因在小鼠细胞内是否成功表达，B错误；人的生长激素基因能在小鼠细胞内表达，说明遗传密码在不同种生物中可以通用，C正确；将转基因小鼠体细胞进行核移植(克隆)，可以获得多个具有外源基因的后代，D正确。

2．(2019·宁波模拟)基因编辑是指将外源DNA片段导入到细胞染色体特定位点或删除基因内部的片段，定点改造基因，获得预期的生物体基因序列发生遗传改变的技术。下图是对某生物B基因进行编辑的过程，该过程中用sgRNA可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的切割位点，下列叙述正确的是(　　)

A．sgRNA是合成Cas9酶的模板

B．sgRNA的碱基序列与靶基因碱基序列能够全部互补

C．核酸内切酶Cas9可在特定切割位点断裂核苷酸之间的磷酸二酯键

D．B基因被编辑后因不能转录而无法表达相关蛋白质

解析：选C。由题意知，sgRNA可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的切割位点，A错误；由图可知，靶基因部分序列与sgRNA通过碱基互补配对原则进行配对，B错误；核酸内切酶Cas9可断裂脱氧核糖核苷酸之间的化学键——磷酸二酯键，C正确；被编辑后的B基因仍能进行转录，D错误。

3．(2019·高考江苏卷)为探究矮牵牛原生质体的培养条件和植株再生能力，某研究小组的实验过程如图。下列叙述正确的是(　　)

A．过程①获得的原生质体需悬浮在30%蔗糖溶液中

B．过程②需提高生长素的比例以促进芽的分化

C．过程③需用秋水仙素处理诱导细胞壁再生

D．原生质体虽无细胞壁但仍保持细胞的全能性

解析：选D。过程①获得的原生质体不能悬浮在30%的蔗糖溶液中，30%的蔗糖溶液可导致原生质体失水皱缩甚至死亡，A项错误；过程②为再分化过程，需提高细胞分裂素的比例以促进芽的分化，B项错误；过程③不需用秋水仙素处理，愈伤组织细胞就已经有了细胞壁，C项错误；原生质体虽无细胞壁，但含有细胞核等结构，即含有全部的遗传信息，原生质体仍保持细胞的全能性，D项正确。

二、非选择题

4．下图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被____________酶切后的产物连接，理由是____________________________。

(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是___________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________和____________，其中既能连接粘性末端又能连接平末端的是____________。

解析：(1)由图(a)可知，尽管BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ两种限制酶的识别位点不相同，但两种酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端，故被BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与图(b)中表达载体被Sau3A Ⅰ酶切后的产物连接。(2)运载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用，由于甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游，故这两个运载体上的目的基因都不能被转录和翻译。(3)常见的DNA连接酶是E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，但作用有所差别，T4DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，而E·coli DNA连接酶只能连接黏性末端。

答案：(1)Sau3A Ⅰ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端

(2)甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录

(3)E·coli DNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶

5．为探究SHH基因与角化囊肿发生的相关性，科研人员利用SHH基因的非模板链转录合成的RNA作为探针，进行分子杂交实验，以检测SHH基因在角化囊肿中的表达情况。其基本流程如图：(Amp表示氨苄青霉素抗性基因；LacZ基因被SHH基因插入后不表达)

请回答下列问题：

(1)重组载体中SHH基因转录合成RNA探针时，________(填“需要”或“不需要”)启动子。

(2)步骤②中，用Ca2＋处理大肠杆菌，使之成为________细胞，然后导入重组载体。实验中，用添加氨苄青霉素的培养基培养大肠杆菌，未导入质粒的细菌将会死亡，原因是这些细菌不含有________基因。

(3)将制备的探针加入角化囊肿切片中，探针将与__________________形成杂交带，进而判断SHH基因的转录情况。

解析：(1)重组载体中SHH基因表达需要启动子。(2)大肠杆菌细胞用Ca2＋处理后就成为感受态细胞；能在添加氨苄青霉素的培养基上生存的细菌含有氨苄青霉素抗性基因，没有氨苄青霉素抗性基因的细菌将会死亡。(3)判断SHH基因的转录情况，也就是判断SHH基因是否转录出mRNA。

答案：(1)需要

(2)感受态　Amp(或氨苄青霉素抗性或抗性)

(3)SHH转录的mRNA(只写mRNA不可)

6．下图是人体免疫物质的制备方法，①～⑥表示不同的过程，请回答下列问题：

(1)方法1中，细胞A应具备的特点是______________。体外培养细胞Y需要满足以下条件：______________、添加了血浆(或血清)的培养基、适宜温度与pH、______________________的气体环境等。

(2)方法2中，通过④得到的目的基因与细胞B中原有基因________(填“一定”或“不一定”)相同，⑤过程必须用到的工具酶有________________________，结构甲的组成必须包括________________________及目的基因等。

(3)若用棉花生产抗体2，⑥过程的受体细胞应选用______________________，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该抗体基因是否在再生植株中正确表达，通常采用________________________法检测植株是否含有该种抗体。

解析：(1)将能够产生抗体的细胞B和细胞A融合后，杂种细胞Y可产生大量的抗体，则细胞A应具有无限增殖的特点。体外培养动物细胞Y，需要满足无菌无毒、添加有血清的培养基、适宜的温度和pH、通入95%的空气＋5%二氧化碳的气体环境等条件。(2)通过④反转录获得的目的基因中，没有内含子等，和细胞B中原有的基因不一定相同；⑤表示目的基因和载体结合，需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶，结构甲是基因表达载体，组成部件一定含有启动子、终止子、标记基因和目的基因等。(3)培养转基因植物时，常采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，则⑥的受体细胞为土壤农杆菌。抗体基因正确表达后会产生抗体，通常采用抗原—抗体杂交的方法来检测目的基因是否成功表达。

答案：(1)能无限增殖　无菌、无毒　含5%CO2、95%空气　(2)不一定　限制性核酸内切酶(限制酶)和DNA连接酶　启动子、终止子、标记基因　(3)土壤农杆菌　抗原—抗体杂交

7．下图是某实验室做的通过动物纤维母细胞等获得单克隆抗体的实验研究。据图回答下列问题：

(1)X、Y、Z细胞的名称分别是________________、________________________、________________。

(2)①过程类似于植物组织培养技术中的________过程。与纤维母细胞相比，诱导干细胞的全能性较___________________________________________________________。

②过程的实质是________________________________________________________。

(3)生产单克隆抗体一般不直接培养浆细胞，主要原因是

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(4)④处需要筛选，从而得到_________________________________________________

细胞，且培养该细胞的气体环境为____________________________________________。

答案：(1)骨髓瘤细胞　抗原刺激过的B细胞(或浆细胞)

杂交瘤细胞　(2)脱分化　高　基因的选择性表达

(3)浆细胞高度分化，不能无限(或大量)增殖　(4)能产生特异性抗体的杂交瘤　95%的空气＋5%的CO2

8．(2019·浙江4月选考)回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题：

(1)通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白(可作为抗原)，可通过________技术获得特异性探针，并将________中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的的基因。

(2)将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测________。

A．质粒载体 B．转录产物

C．抗性基因 D．病原微生物

(3)植物细胞在培养过程中往往会发生________，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入____________________，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用________培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。

(4)用抗病品种与高产品种进行杂交育种的过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是________。

答案：(1)单克隆抗体　基因文库　(2)B　(3)变异　高浓度致病真菌　花粉离体　(4)胚的离体培养

9．下图表示利用生物技术获得转基因猪和转基因烟草的过程(图中数字表示过程或技术，字母表示物质或结构)。请回答下列问题：

(1)为分离、提纯苏云金芽孢杆菌，先用________培养基进行扩大培养，再用________法进行分离，获得一个个单独的________。

(2)研究过程中，采用________技术对目的基因进行扩增，然后将目的基因与质粒等载体结合形成了重组质粒。在重组质粒的构建过程中需要的工具酶有________________________________________________________________________

________________________。

(3)图中②代表__________技术。培养C中的ES细胞时，一般要在培养皿底部制备一层胚胎成纤维细胞，目的是________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(4)若在0.5～0.6 mol/L的________溶液中用特定的酶处理D，可获得原生质体。若将含有D的培养物放在摇床上，通过________培养可以分散成单细胞，这些单细胞具有________细胞的特征。

(5)使用自然生长的烟草茎进行组织培养，需要依次在70%酒精和________溶液中浸泡消毒。各种器皿和培养基等通常用______________________法灭菌。

(6)从经特定免疫处理的猪中提取B淋巴细胞，与______________融合，形成杂交细胞，经筛选、克隆化培养后，获得的单一细胞特征是_____________________________________

___________________________________。

解析：(1)LB培养基是培养细菌常用的培养基，液体培养基有利于微生物细胞与营养物质充分接触，利于增殖，故扩大培养应用LB液体培养基；涂布分离法和划线分离法是两种常用的微生物分离方法，前者效果更佳，后者操作相对简便；细菌在固体培养基表面生长增殖会形成细胞集合体，即菌落。

(2)PCR是一种人工控制的细胞外DNA复制技术，可用于目的基因的扩增；重组质粒形成时需先用同种限制性核酸内切酶将质粒和含目的基因的DNA进行切割，然后用DNA连接酶将二者拼接。

(3)将目的基因导入猪的受体细胞(受精卵)中，需先利用胚胎体外培养技术将转基因受精卵培育成早期胚胎，然后移植到代孕母猪体内孕育，最后分娩产出转基因猪；培养ES细胞时，在培养皿底部制备一层胚胎成纤维细胞(饲养层)，目的是促进ES细胞生长、抑制其分化、保证其可以顺利增殖。

(4)甘露醇可维持溶液较高渗透压，防止原生质体吸水涨破；摇床上进行液体悬浮培养可使细胞在液体中分散，避免彼此接触，保持单细胞的存在状态；这些单细胞细胞质丰富、液泡小、细胞核大，具有胚性细胞的特征。

(5)为防止微生物的污染，应用70%酒精和5%次氯酸钠溶液对植物组织进行消毒，器皿和培养基经高压蒸汽灭菌处理。

(6)经特定免疫处理的B淋巴细胞可产生抗体，骨髓瘤细胞可无限增殖，将两种细胞融合在一起得到杂交瘤细胞，其具有二者优点，既能产生特异性抗体，又能无限增殖。

答案：(1)LB液体　划线分离(涂布分离)　菌落

(2)PCR(聚合酶链式反应)　限制性核酸内切酶和DNA连接酶

(3)胚胎体外培养　促进ES细胞生长、抑制其分化

(4)甘露醇　液体悬浮　胚性

(5)5%次氯酸钠　高压蒸汽灭菌

(6)骨髓瘤细胞　既能产生特异性抗体，又能无限增殖