高中生物人教版 (2019)选择性必修3重组DNA技术的基本工具说课ppt课件

这是一份高中生物人教版 (2019)选择性必修3重组DNA技术的基本工具说课ppt课件，共73页。PPT课件主要包含了基因工程的诞生和发展，EcoRⅠ，课堂小结，DNA的粗提取与鉴定等内容，欢迎下载使用。
　　指按照人们的愿望, 通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。
操作环境： 操作对象： 操作水平： 工程原理： 工程产物：
1、不同生物的基因为什么能拼接？
2、外源基因为什么能在受体细胞中表达？
(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)DNA分子都遵循碱基互补配对原则(3)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(1)基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。
基因工程诞生的理论基础
1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。
1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。
1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。
1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
1985年，穆里斯等人发明了PCR。
1990年，人类基因组计划启动。2003年完成
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
3.1 重组DNA技术的基本工具
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。 DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
思考：解决培育番木瓜的关键步骤需要哪些分子工具呢？
抗病基因与运载体DNA“缝合”
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶
主要从原核生物中分离纯化出来的
（1）能够专一性识别双链DNA分子的特定核苷酸序列； 一般由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
（2）使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
1、能被限制酶特异性识别的切割位点一般都具有回文序列：即在切割位点，DNA一条链正向读的碱基序列与另一条反向读的碱基序列完全一致。
回文序列——反向对称重复排列即：一条链从5’往3’读的碱基顺序与另一条链从5’往3’读的顺序完全一致。
①DNA中文全称:　　　　　　　②组成元素:　　　　　　　　③基本单位:　　　　　　　　　
C H O N P
= 磷酸 + 脱氧核糖 + 含氮碱基
一个核苷酸脱氧核糖上第3位C的羟基，与下一个核苷酸脱氧核糖上第5位C的磷酸羟基，脱水缩合成酯键，该酯键称又3,5磷酸二酯键。
复习：DNA的空间结构特点：
①两条脱氧核苷酸长链反向平行盘旋而成双螺旋结构。②脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在内侧。③两条链上的碱基通过氢键连接成碱基对，A与T(两个氢键)，G与C配对(三个氢键)。碱基之间这种一一对应的关系，叫做碱基互补配对原则。
EcR I(在G与A之间切割)
Sma I(在G与C之间切割)
（1）黏性末端 限制酶在它识别序列的中心轴线两侧，将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是粘性末端。
经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，黏性末端和平末端。
A.形成的黏性末端（从5’往3’读）为_____B.一个限制酶切割一次断两个磷酸二酯键形成___个黏性末端C.同一种限制酶切割形成的黏性末端____D.两个黏性末端有___个游离的磷酸基团
①不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同。【解析：酶具有专一性，识别的序列相同】
②判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180度，若与另一个完全相同，则说明两个末端是用同一种限制酶切割
已知EcRⅠ的识别序列和切点是—G↓AATTC—，BamHⅠ的识别序列和切点是—G↓GATCC—
③同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同；【解析：酶具有专一性，识别的序列不同】
已知BamHⅠ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的识别序列和切点是—↓GATC—
同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同,(也有可能切割出相同的黏性末端，可以相互配对连接成链）
总结：产生相同的黏性末端不一定都是用同一种限制酶切割
（2）平末端 限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
不同限制酶切割形成的黏性末端，如果互补则可以相互重新配对连接
总结：两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
限制酶存在于原核生物中，主要的作用是什么？
原核生物易受自然界外源DNA入侵，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，限制酶就是它的一种防御性工具。 当外源DNA入侵时，它会利用限制酶将外源DNA切割掉，使之失效，从而保护自身的安全。
限制酶不剪切细菌本身的DNA的原因是什么？
经过长期的进化，含有某种限制酶的细菌，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到限制酶所识别序列的碱基上。使限制酶不能将其切开，这样尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，却可以防止外源DNA的入侵。
限制酶具有特异性，一种限制酶一般只能识别和切割某种特定的核苷酸序列，这是由酶的专一性决定的。限制酶是一类酶而不是一种酶，它的作用是断开磷酸二酯键。
属名Escherichia首字母
从中分离的第一个限制酶
例如：流感嗜血杆菌(Haemphilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
限制性核酸内切酶的命名
切开的黏性末端或平末端如何连接起来呢
能够将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，就是DNA连接酶。
将双链DNA分子片段缝合起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
（1）E.cli DNA连接酶 来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来。
（2）T4 DNA连接酶 来源于T4噬菌体。 既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，也能连接双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。
E·cli DNA连接酶
能连接黏性末端和平末端(效率较低)
【小结1】E·cli DNA连接酶和T4DNA连接酶的区别
DNA连接酶和DNA聚合酶
相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶。不同点：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板； DNA连接酶连接的是DNA片段。
切割目的基因及质粒载体，识别特定核苷酸序列，切开特定部位的磷酸二酯键
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上
将DNA两条链之间的氢键打开
5´GAATTC 3´
可能是剪切位点或连接位点选得不对，需重新操作
外源基因很难进入细胞，进入后也不容易稳定存在并表达，怎么解决这个问题呢？
将外源基因送入受体细胞，还需要有运输工具，这就是分子运输车，又叫载体或运载体。作用作为运输工具，将目的基因转移到受体细胞内。
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
（1）载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？ 具有一个至多个限制酶切割位点供外源DNA片段插入。（2）要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，需要具备什么条件？ 能在受体细胞内进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。（3）为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？ 具有特殊的标记基因，用于筛选含重组DNA分子的细胞。常见的标记基因有四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等。
扩展：标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
也可以用荧光蛋白基因做标记
（1）最常用的载体是质粒 质粒是一种裸露的结构简单的，独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。质粒是基因工程中最常用的载体。 质粒来源于细菌、霉菌和酵母菌等的细胞质，对细胞的正常生活几乎没有影响，最常用的是大肠杆菌质粒。
（1）最常用的载体是质粒 基因工程中用的质粒都是天然质粒吗？ 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。例如加上一些特殊的标记基因。（2）噬菌体（3）动植物病毒 它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。
细胞膜上的载体与基因工程中的载体比较
①细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞, 与细胞膜的选择透过性有关；②基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
①细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；②基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物；也可能是生物，如动植物病毒等。
1．提取思路 DNA、RNA、蛋白质和脂质在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异选用适当的物理或化学方法对他们进行提取。
2．提取原理　　DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用此原理可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 ml/L的NaCl溶液。3．鉴定原理　　DNA遇二苯胺，在沸水浴条件下，会出现蓝色。注意事项：二苯胺试剂要现配现用，鉴定时溶液蓝色的深浅与溶液中含量的多少有关。
1．植物材料　　新鲜的洋葱，菠菜，菜花，香蕉，草莓等。2．动物材料　　新鲜的猪肝等。　　可以选用猪的血液作为实验材料吗？为什么？　　不可以，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，DNA含量太少。
3．试剂 研磨液体积分数为95%的酒精2 ml/L的NaCl溶液二苯胺试剂蒸馏水等。（研磨液和二苯胺的配方参见附录2）
——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
——鉴定DNA，要现配现用
滴入NaCl溶液中，使浓度下降至0.14ml/L，析出DNA
破坏细胞，释放出细胞内的物质，维持DNA稳定，提高DNA溶解度
含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
二苯胺试剂要现配现用，用棕色瓶保存。
《教材》P117——附录2
4．用具 烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
1．植物材料含有细胞壁，如何破除细胞壁？有无其他方法？ 研磨法去除细胞壁；也可以加入纤维素酶提高研磨效果。2．第一次过滤后DNA在沉淀中还是上清液中？
3．析出时为什么要选用预冷的酒精溶液？ 可抑制水解酶的活性，抑制DNA降解；抑制分子运动，使DNA易形成沉淀；有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。4．搅拌时需要如何操作？ 应用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，避免破坏DNA。5．还有什么方法可以代替冷却的酒精析出DNA？ 离心后取沉淀物。
称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中。
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r / min 的转速下离心5 min ，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA ）晾干。
取两支试管，各加入2ml/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
1 ．研磨洋葱 称取约30 g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨。2．过滤获取含DNA的上清液 方法一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，取上清液。 方法二：直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500 r/min的转速下离心5 min，取上清液。
3．析出DNA 方法一：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
3．析出DNA 方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r/min的转速下离心5 min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
当实验试剂缺乏时，可以用家用洗洁精或洗衣粉（含有蛋白酶的表面活性剂）代替研磨液，也能达到裂解细胞膜、让蛋白质变性的目的。还可以在研磨过滤后的滤液中加入嫩肉粉（含有木瓜蛋白酶）促使蛋白质水解。
①取一段长约2 cm的去皮香蕉，剪碎置于玻璃杯中。②加入10 mL温水，2 g食盐，5滴洗洁精，充分研磨。③用双层纱布过滤研磨液，收集滤液。④向滤液中加入2 g嫩肉粉，混合均匀。⑤将滤液置于55~60℃（木瓜蛋白酶作用的最适温度）的水浴中加热5～10 min⑥冷却，加入等体积、预冷的体积分数为95％的酒精。⑦静置2～3 min，用玻璃棒（或筷子）挑取白色絮状析出物。
香蕉中DNA的粗提取实验
1．你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？ 观察提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈蓝色说明实验基本成功；如果不呈蓝色，可能的原因有：提取的DNA含量低，实验操作失误等。2．你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗? 核蛋白、多糖等杂质。
3．与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。 对比各个小组DNA的纯度、颜色、二苯胺试剂显色的深浅等。如果为同一种实验材料却出现较大差异，可能是实验操作不够规范造成；如果为不同材料，可能与材料本身DNA含量多少有关。
本实验只是对DNA进行了粗提取，请在阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。 例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿一异丙醇混合液(体积比为24:1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
1．以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。2．利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。3．不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。4．为减少DNA的损失，过滤过程一般使用纱布过滤（滤孔大）
5．提纯DNA时，选用体积分数为95%的冷酒精的原因：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。6.实验中出现的丝状物的主要成分是DNA，实际上每一根“丝”都是由许多DNA分子聚集在一起形成的，应用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，避免破坏DNA，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。7.粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白质等
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 （ ） A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氨键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （ ） A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C. DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分了？
迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样,尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
2. 有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcRⅤ和XhⅠ进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：(1) 哪种限制酶切割B片段产生的DNA 片段能与限制酶SpeⅠ切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端（可互补）
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如,，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
【例13】下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验原理的叙述，正确的是(　　)A．DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl溶液浓度的升高而减小B．利用DNA不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的DNAC．DNA是大分子有机物，易溶于水也溶于某些有机溶剂D．在沸水浴中，DNA遇二苯胺会出现紫色反应
【例14】DNA的粗提取中，加入与滤液体积相等的、冷却的某物质的溶液，静置2～3 min，溶液中会出现白色丝状物。上面提到的某物质的溶液是指(　　)A．0.9%的NaCl溶液B．0.14 ml/L的NaCl溶液C．质量分数为15%的HCl溶液D．体积分数为95%的酒精溶液
在生产中，啤酒酵母菌除用于酿造啤酒及其他的饮料酒外,还可用于面包发酵。菌体的维生素和蛋白质含量高,可食用、药用和作饲料等。科学家将大麦的LTP1基因植入啤酒酵母菌中,获得的转基因啤酒酵母菌种可表达出LTP1蛋白,并酿出泡沫丰富的啤酒。其基本的操作过程如下图所示:
(1)这种技术 地改变了啤酒酵母菌的性状,在可遗传变异的来源中，它属于________。 (2)将LTP1基因导入酵母菌细胞内,所利用到的载体是________。 (3)题图中C 进入的啤酒酵母菌分别在含有青霉素、四环素的两种选择培养基上的生长情况是 。
在含有青霉素的培养基上能存活,在含有四环素的培养基上不能存活
3．基因运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是 （　 　） A．能够复制，以便目的基因插入其中 B．具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达 C．具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选 D．对受体细胞无害，便于重组DNA的筛选