高中生物重组DNA技术的基本工具备课课件ppt

这是一份高中生物重组DNA技术的基本工具备课课件ppt，共42页。PPT课件主要包含了目的基因等内容，欢迎下载使用。
学习目标：1.阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。2.进行DNA的粗提取与鉴定。
重难点：1.阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。2.基因工程载体需要具备的条件。3.进行DNA的粗提取与鉴定。
资料1：我国是棉花的生产和消费大国，棉花种植过程中常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。资料2：苏云金杆菌的Bt抗虫基因可以表达出Bt抗虫蛋白，破坏棉铃虫的消化系统，从而杀死棉铃虫。 问：如何培育具有抗虫特性的棉花呢？
资料3：番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
获得新的生物类型和生物产品。
基因（具有遗传效应的DNA片段）
克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状。
案例：培育抗番木瓜环斑病毒的木瓜
问：为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？（拼接的基础）
1.DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）
2.都遵循碱基互补配对原则
3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
问：为什么一种生物的基因（目的基因）可以在另一种生物细胞内表达？（表达的基础）
1.基因是控制生物性状的独立遗传单位
2.基因的表达都遵循“中心法则”
3.生物界几乎共用一套遗传密码
相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质。
数千种（限制酶是一类酶，不是一种酶）
能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
【P71旁栏】根据限制酶的功能，推测其在原核生物体内主要有什么作用？
细菌体内的限制性酶，可切割外源DNA（例如被噬菌体侵染），使之失效，从而达到保护自身的目的（防御机制）。
限制酶的命名：阅读P72【资料卡】
①大多数限制酶的识别序列由 组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。②都可以找到一条 ；③中轴线两侧的双链DNA上的碱基是 、 的，称为 。
注：1.限制酶只能识别DNA双链，不识别RNA或DNA单链。2.限制酶识别过程具有方向性，都是从5’→3’开始读；一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的碱基顺序完全一致。
练.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）A．GAATTC B．GGGGCCCC CTTAAG CCCCGGGGC．CTGCAG D．CTAAATC GACGTC GATTTAG
【拓展应用P74】为什么限制酶不剪切 细菌本身的DNA？
通过长期的进化，含有某种限制酶的细菌DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
（1）产生黏性末端：在识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开。
例：EcR Ⅰ 限制酶 ——只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开
切开的DNA两条单链的切口处伸出的几个核苷酸，正好互补配对，这样的切口叫作黏性末端。
5’ 3’
（2）产生平末端：在识别序列的中轴线将DNA的两条链切开。
例：Sma Ⅰ限制酶 ——只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开
从识别序列的中心轴线处切开DNA两条单链时，切口是平整的，这样的切口叫平末端。
5’ 3’
3’ 5’
思考：结合右图，推断限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，消耗 分子水，产生 个黏性末端。
练1.写出下列限制酶切割形成的粘性末端
BamHⅠ EcRⅠ________ Hind Ⅲ Bgl Ⅱ ________
练2. 下列黏性末端最可能由同种限制酶切割而成的是( )① -TCG ②-GA ③AATTC- ④AGCTTC- -AGCTTAA -CTTCCA G-　　　　　 AG- A.①② B.①③ C.①④ D.②③
不同限制酶识别的序列不同，但切割产生的黏性末端可能相同。P75——同尾酶
3’ 5’
练3.使用EcR I剪切出目的基因
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
5’ 3’
要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切 个切口，可产生 个黏性末端， 个游离的磷酸基团。
同种限制酶切割产生的黏性末端相同。因为酶具有专一性，识别的序列相同。
4.判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。
5.下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，回答：用EcR Ⅰ 酶切，能得到 种DNA片段；用Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 种DNA片段；同时用Sma Ⅰ 和Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 ____种DNA片段
1.作用：将 “缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。
用同种限制酶切割(EcRⅠ)
注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
①E.cli DNA连接酶:来源于_________,②T4 DNA连接酶:来源于_________.
E.cli DNA连接酶连接 效率远低于T4 DNA连接酶
判断：（1）两个DNA片段的黏性末端必须互补才能通过DNA连接酶连接起来。（2）T4 DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率相同。（3）DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。
DNA连接酶：连接两个DNA片段
DNA聚合酶：将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键。
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子或DNA的一条链
思考：若DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端，再经过DNA连接酶处理后，形成的新的识别序列，能否再被所用的限制酶识别？
（1）若两个相同黏性末端都是由同种限制酶（EcR Ⅰ）切割后所得， （填“能”或“不能”） 再被所用的限制酶识别。
（2）若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得，形成的新的识别序列 （填“能”或“不能”）再被所用的限制酶识别。
1.载体的作用是什么？
将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
不同的载体来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别。
思考：噬菌体或某些动植物病毒作为载体，其原理是利用 。病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 性。若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体。
病毒对宿主细胞的侵染性
3.最常用的载体——质粒（其基因属于细胞质基因）
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。注：被用作载体的质粒，都是在天然质粒基础上进行过人工改造的。
4.载体需具备的条件：
①有一个至多个限制酶切割位点，便于插入目的基因；
②在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；
③具有标记基因，便于筛选含有重组DNA分子 的细胞；
④对受体细胞无害、易分离。
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。 将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
未导入质粒的大肠杆菌细胞
导入质粒的大肠杆菌细胞
注：重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低。
①其他抗生素抗性基因：抗四环素基因②标记基因也可用荧光蛋白基因
练：用右图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。若在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应该选择的限制酶为 。
5.目的基因要与运载体（质粒）结合，如何处理质粒？
用相同的限制酶切割目的基因和运载体，产生相同末端，然后用DNA连接酶将目的基因片段与质粒连接，形成重组质粒。
用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶（同尾酶）分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段。
缺点2：目的基因自身环化
缺点3：反向连接重组DNA
用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段
优点1：质粒不会重新环化
优点2：目的基因 不会被环化
优点3：目的基因与质粒 不会发生反向连接
练：图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株:
（1）上述操作中不宜选用Sma I，原因是Sma I会破坏 ____________和 。（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcR I，原因是用EcR I切割外源DNA 片段后， 。
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
【小结】 限制酶的选择：选目的基因两端和载体都有酶切位点； 所选酶切位点不能破坏目的基因和标记基因。 切割目的基因：能切下目的基因且不破坏目的基因； 切割质粒时：至少保留一个完整的标记基因，便于筛选。
A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是bC.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b
某细菌质粒上有标记基因如图所示，外源基因插入的位置不同（插入点有a、b、c），细菌在培养基上的生长情况也不同，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ 　）
1.提取原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面 的差异，提取DNA，去除其他成分。
①DNA 酒精，但某些蛋白质 酒精，可用酒精初步分离DNA（酒精中析出）和蛋白质。
②DNA在不同浓度的 中的溶解度不同，能溶于2 ml/L的NaCl溶液，可溶解和提取DNA。
③鉴定：一定温度下，DNA被 染成 。
富含DNA的材料，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、鸡血、猪肝等。问：不能选什么细胞？
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
二苯胺有毒，现配现用并用棕色瓶存放
取洋葱切碎，放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）
①研磨目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。②时间不宜太长：防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量。③不宜太用力 ④有条件的可在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶。 （有利于充分研磨）
问：若材料选的是动物细胞，破碎细胞可采用什么方法？
动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
上清液中可能含有核蛋白、多糖等杂质。
问：上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
为减少 DNA 的损失，过滤一般使用纱布不用滤纸。
在上清液中加入体积相等、 的酒精溶液(体积分数为 ), 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去水分；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物（粗提取的DNA ）晾干。
某些蛋白质溶于酒精，而DNA不溶于酒精。
酒精预冷的作用：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
加入2ml/L氯化钠溶液
问：为什么是2ml/L氯化钠？
问：用二苯胺试剂鉴定的结果如何？若实验组不出现蓝色或蓝色较浅，是什么原因？
不呈现蓝色，可能是提取的DNA含量低，或在实验操作过程中出现了失误等。结果差异原因：①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。
思考：粗提取出的丝状物或沉淀物一定是白色吗？若不是白色，说明什么？
说明DNA中的杂质较多。
可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
【拓展】为了提纯DNA，某同学提出以下实验方案，分析：
操作1:得到的DNA粗提取物（丝状物或沉淀）加入2ml/L的NaCl溶液溶解， 过滤，取滤液（DNA提取液）。操作2:上述得到的DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液的浓度为 0.14ml/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。
2ml/LNaCl的目的：______________________________________________________
溶解DNA，除掉高盐溶液中不能溶解的杂质，提纯DNA液。
NaCl溶液浓度，从而 DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出，除掉溶解在低盐溶液中的杂质。
方法1：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
方法2：先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。
方法3：由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可将两者分开。
1.(2022山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验, 下列说法错误的是(　　)A.过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
【P75拓展应用】有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcRV和XhI进行切割。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接?
XbaⅠ。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义?
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。