高中生物重组DNA技术的基本工具示范课ppt课件

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【复习】基因的结构和功能
1.基因与DNA的关系？2.基因的基本单位是什么？
基因是有遗传效应的DNA片段
储存、传递、表达遗传信息
1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。
1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。
1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。
1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
1985年，穆里斯等人发明了PCR。
1990年，人类基因组计划启动。2003年完成
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中，常会受到一些虫害的侵袭，其中以棉铃虫最为常见，它可以使棉花产量减少三分之一，甚至绝收。
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫 重组DNA技术。
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
国家重点科技攻关项目——“基因重组人胰岛素”，日前在吉林省通化东宝药业股份有限公司研制成功，并于近日批量投放市场。我国由此成为世界上第3个能够生产、销售基因重组人胰岛素的国家。该项研究成果填补了国内基因重组人胰岛素的空白，加速了国内动物胰岛素的淘汰和替代进口产品，减轻了糖尿病患者的痛苦，为造福人类，推动科技进步做出了重要贡献。
问题一：如何获取人的胰岛素基因?
问题二：如何将人胰岛素基因与大肠杆菌DNA相连接?
问题三：如何将人胰岛素基因运送到大肠杆菌细胞呢？
第3章 基因工程第1节重组DNA技术的工具
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
阅读教材P71，回答下列问题：1.限制酶的来源？2.限制酶的特点？3.限制酶的作用部位？4.限制酶的识别序列长度？5.限制酶的切割结果？
主要从原核生物中分离纯化来的
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数4个、8个或其他数量
如何理解限制酶对双链DNA分子的特异性识别和切割？
特定切点上的磷酸二酯键
属名Escherichia首字母
种名cli 前两个字母
从中分离的第一个限制酶
例如：流感嗜血杆菌(Haemphilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
（1）实例1——EcRⅠ限制酶切割 *EcRⅠ识别序列为GAATTC *EcRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键
*形成的黏性末端（从5’往3’读）为_____
（2）实例2——SmaⅠ限制酶切割 *SmaⅠ识别序列为CCCGGG *SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键
【检测1】：写出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________ EcRⅠ________HindⅢ ________ BglⅡ ________
思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？
一定相同, 不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端
有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcRⅤ和XhⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
(1)请写出限制酶SpeⅠ、HindⅢ、XbaⅠ和XhⅠ切割形成的黏性末端。
SpeⅠ：　　　　HindⅢ：　　　　XbaⅠ：　　　　XhⅠ：
【检测2】：教材P74课后题拓展应用2
【检测2】：教材P74课后题拓展应用2有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcRⅤ和XhⅠ进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：(2)哪种限制酶切割B片段产生的DNA 片段能与限制酶SpeⅠ切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端（可互补）
限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、起防御作用。
原核细胞DNA中不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了。
为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：
（1）限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
（2）请结合右图，推断限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端，消耗 分子水。
限制酶只能识别并切开双链DNA分子
用同种限制酶切割(EcRⅠ)
什么样的末端才能连接起来？，
⑴ E·cli DNA连接酶⑵ T4 DNA连接酶
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
DNA连接酶——“分子缝合针”
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
E·cli DNA连接酶的缝合作用
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
E·cli DNA连接酶或T4DNA连接酶连接黏性末端
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
T4 DNA连接酶可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，效率低
E·cli DNA连接酶在基因工程中的应用
即可连接黏性末端，又可连接平末端
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
思考(72页)：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
A A T T G
回顾：DNA聚合酶的作用
都能催化形成磷酸二酯键
以DNA的一条链为模板
形成完整的重组DNA分子
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
只能催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
【归纳】DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：
根据所学知识，完成以下填空：①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶
1.切断a处的酶为_______2.连接a处的酶为_______3.切断b处的酶为_______
a：磷酸二酯键；b：氢键
与DNA相关的4种酶的比较
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链
质粒、噬菌体、动植物病毒等
基因导入受体细胞的载体——“分子运输车”
质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
任务：分析归纳载体需要具备的条件：问题1：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
条件①：具有一个或多个限制酶切割位点；
条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；
条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
条件④：载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
实例： 重组DNA分子的模拟操作
思考讨论：1.剪刀和透明胶带或订书针分别代表哪种“分子工具”？2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
质粒、 噬菌体、动植物病毒
一、概念检测1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ） A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C.DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针
拓展练习75页：下列操作中选用哪种限制酶切割构建重组DNA分子？（注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，ne表示新霉素抗性基因）
防止目的基因的自身环化防止目的基因反向连接到载体
2.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是(　　) A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
探究.实践 DNA的粗提取与鉴定
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质上的差异，提取DNA，去除其他成分。
2、细胞中除了DNA，还有哪些生物大分子？
1、DNA分子存在于细胞中的哪些结构呢？
真核细胞：细胞核（染色体）、线粒体、叶绿体原核细胞：拟核、质粒
3、如何去除其他成分，提取DNA？
RNA、蛋白质、脂质、糖类等
（1）DNA不溶于酒精溶液
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
DNA在 2 ml/L 的NaCI溶液中溶解度 较大 在 0.14ml/L 的NaCI溶液中溶解度 较小
——初步分离DNA与蛋白质
1、DNA粗提取的基本原理：
不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，你认为应该遵循什么原则？
DNA含量高、材料易得、便于提取
你认为如下提供的材料中是否都适合提取DNA？为什么？
哺乳动物的红细胞（DNA数目0条）
（21年天津卷）孟德尔说：“任何实验的价值和效用，决定于所使用材料对于实验目的适合性”．下面实验材料的选择不合适的是（　　）A．用洋葱的鳞片叶表皮观察细胞的质壁分离和复原现象B．用洋葱根尖分生区观察细胞有丝分裂C．用洋葱鳞片叶提取和分离叶绿体中的色素D．用洋葱鳞片叶粗提取DNA
①称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液（替代：加适量水、洗涤剂、SiO2），充分研磨。
②在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
步骤1：研磨 破碎细胞，获取DNA
3、实验收集的是滤液还是沉淀呢？
2、实验用纱布过滤而不用滤纸,为什么?
纱布，为了减少DNA的损失
1、低温放置几分钟的作用？
抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
4.粗提取的DNA中可能会含有哪些杂质？
蛋白质、多糖、RNA等杂质
③在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
向滤液中加入等体积的（95%）预冷酒精溶液，静置2-3min，用玻璃棒沿着同一方向缓慢搅拌，卷起白色丝状物。
问题2：若提取物不是白色丝状物，可能原因是什么？
问题1：为什么沿着同一方向缓慢搅拌？
在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
加入2ml/L NaCl溶液
若实验组颜色不变蓝，可能原因是？
①实验材料的选取失误 ②材料中的核DNA没有充分释放，如研磨不充分或收集的滤液的量过少 ③加入酒精后摇动或搅拌过猛，DNA被破坏
①研磨液：②体积分数为95%的酒精：③2ml/L的NaCl溶液：④二苯胺试剂：
破坏细胞，释放出细胞内的物质
鉴定DNA，要现配现用
如果实验材料是鸡血细胞，获取DNA滤液的方法一样吗？
用蒸馏水破碎细胞，因为血细胞在蒸馏水中大量吸水涨破
探究.实践 DNA的粗提取与鉴定
1．某同学用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列操作错误的是(　　)A．加入研磨液后用力进行快速、充分的研磨 B．用蛋白酶纯化过滤后的研磨液中的DNA C．加入酒精后用玻璃棒轻缓搅拌 D．加二苯胺试剂摇匀后沸水浴加热
2．在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，有关说法正确的是(　　)A．向洋葱组织中倒入蒸馏水并搅拌可释放核DNAB．利用DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度的不同可提取DNAC．加入预冷的体积分数为75%的酒精溶液，静置2～3 min，溶液中出现的白色丝状物为DNAD．DNA鉴定操作中，只要向溶有DNA的NaCl溶液中加入4 mL的二苯胺试剂，即可出现蓝色
3.下表关于DNA粗提取与鉴定实验的表述,不正确的是(　　)
4. 下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,正确的是(　　)A.新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取B.植物材料需先研磨破碎细胞C.DNA只能溶于2 ml/L的NaCl溶液D.溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后颜色呈紫色
5.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验叙述，错误的是(　　)A.酵母和菜花均可作为提取DNA的材料B.DNA既溶于2 ml/L NaCl溶液也溶于蒸馏水C.向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物D.DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝
6．下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。请据图回答下列问题：
(1)图中实验材料A可以是_____________等。(2)通过上述所示步骤得到滤液C后， 再向滤液中加入2 ml/L的NaCl溶液的目的是____________________，再过滤得到滤液D，向滤液D中加入蒸馏水的目的是_____________。
使DNA(溶解度下降而沉淀)析出　
(4)DNA鉴定的原理是_________________。
(3)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得下表所示的4种滤液，含DNA最少的是滤液________。
在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色
3.如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，回答下列问题：
(1)右述图示中，该实验的正确操作顺序是__________________________ (用序号与箭头表示)。(2)步骤④中使用2 ml/L NaCl溶液的目的是 。
(3)步骤①的目的是 ，其依据的原理是 。
(4)步骤①中所得到的丝状物为 色，若要鉴定其主要成分为DNA，可滴加 试剂， 后，如果出现 则证明该丝状物的主要成分为DNA。