生物重组DNA技术的基本工具图片ppt课件

这是一份生物重组DNA技术的基本工具图片ppt课件，共41页。PPT课件主要包含了基因工程，生物体外，DNA分子水平，人类需要的基因产物，基因重组，中心法则，基因工程发展历程，从社会中来，作用结果，形成黏性末端和平末端等内容，欢迎下载使用。
　　指按照人们的愿望, 通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。
操作环境： 操作对象： 操作水平： 工程原理： 工程产物： 意义：
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
1）DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸2）都遵循碱基互补配对原则3）双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
思考1:DNA为何能在不同生物间进行转移与拼接？
1）基因是控制生物性状的结构与功能单位2）遗传信息传递都遵循中心法则3）生物界几乎共用一套遗传密码
思考2：外源基因在受体细胞中能表达的原因？
1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。
1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。
1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。
1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
1985年，穆里斯等人发明了PCR。
1990年，人类基因组计划启动。2003年完成
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。 DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
思考：解决培育番木瓜的关键步骤需要哪些分子工具呢？
步骤一：抗病基因的提取出来
步骤二：抗病基因与运载体DNA“缝合”
步骤三：抗病基因进入 番木瓜
思考：1.剪刀破坏的是DNA的什么结构？
磷酸二酯键,形成若干个DNA片段
2.剪刀属于哪种“分子工具”？ 3.使用DNA水解酶可以吗？
不可以，DNA水解酶会将DNA水解成单个脱氧核糖核苷酸
5’… GAATTCCCGGGAGA…CCCGGG…G CCCGGGAATTCCGGATCC …3’3’… CTTAAGGGCCCTCT …目的基因… CGGGCCCTTAAGG CCTAGG…5’
一、重组DNA技术的基本工具
（一）限制性内切核酸酶-“分子手术刀”
能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
特定切点上的磷酸二酯键
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
限制酶(EcRⅠ)能识别 序列，并在 和 之间切开 键,形成 末端。
-GAATTC--CTTAAG-
当限制酶从识别序列的中心轴线两侧将DNA两条单链分别切开，带有几个伸出（未配对）的核苷酸，这样的切口叫黏性末端。
限制酶(SmaⅠ)能识别 序列,并在 和 之间切割形成 ___末端 。
-CCCGGG--GGGCCC-
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
大肠杆菌（Escherichia cli）R型菌株中分离出的第一个限制酶: 。
粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶: 。
练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemphilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为: 。
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
BamHⅠ EcRⅠ__________________________ Hind Ⅲ Bgl Ⅱ _________________________
1.写出下列限制酶切割形成的末端序列
-GATCC G-
-AATTC G-
-AGCTT A-
-GATCT A-
【思考】同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？ 不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
(3)限制酶所识别的序列反向对称重复排列。
(1)限制酶具有________性。一种限制酶一般只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
(2)同一种限制酶一定能切出_______黏性末端，不同限制酶可能切出_________黏性末端，同样能连接。
2.以下黏性末端是由_____种限制酶作用产生的
思考1：推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。
思考2：试推测限制酶为什么不会切割细菌自身的DNA？
含有某种限制酶的细菌的DNA分子不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰（甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。）
限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。
思考：切开的黏性末端或平末端如何连接起来呢？
（二）DNA连接酶-“分子缝合针”
将 “缝合”起来，恢复被 切开的两个核苷酸之间的______________。
能够将 连接起来的酶，称之为DNA连接酶。
E.cli DNA连接酶
①…CTGCA …G
G…
A. ①③；②④ B. ①②；③④ C. ①④；②③ D.以上都不对
以下哪些末端能够重新组合在一起？
① ③连接在一起后，____________（能/不能）再被限制酶识别。
② ④ 连接在一起后，____________（能/不能）再被限制酶识别。
思考：DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA连接酶作用对象：
DNA聚合酶作用对象：
都能催化形成磷酸二酯键
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
2.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是(　　) A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制.
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
（三）载体-“分子运输车”
①能在受体细胞中稳定保存并复制②有一个至多个限制酶切割位点，便于插入（携带）目的基因③具有标记基因，便于筛查含有重组DNA分子的细胞④对受体细胞无害、易分离
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
3.运载体需具备的条件：
标记基因的筛选原理： 一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
扩展：标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，导入了载体并成功表达了的受体细胞才能够生存。如图所示：
也可以用荧光蛋白基因做标记
1.以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是
A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的B.②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
质粒、λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）A.大肠杆菌的质粒 B. 切割DNA分子的酶C. DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针
提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
a、DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精b、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2ml/L NaCl溶液
c、在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
新鲜洋葱或香蕉、菠菜、菜花、猪肝等。
SDS（十二烷基磺酸钠）：
EDTA（乙二胺四乙酸）：
使DNA保持稳定状态。
能有效的破坏细胞膜的磷脂和膜蛋白。
是一种DNA酶的抑制剂，可防止细胞破碎后DNA酶降解DNA;
Tris-HCl的缓冲体系（PH=8.0）：
鉴定DNA，要现配现用
称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨；
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。或将洋葱研磨液倒入塑料离心管中离心，在1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
搅拌时动作要轻缓的原因
取两支20mL的试管，各加入2ml/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。
向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
　在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺试剂会被染成蓝色
【请同学们补充完整以下实验步骤】
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色，说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
本实验出提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同分析产生差异的原因。
从多种方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料，哪种提取方法的效果更好。
本试验只是对DNA进行了粗提取，请查阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。　　例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿——异丙醇混合液（体积比为24:1），通过离心将蛋白质及其它杂质除去，取清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的粘稠液体。此外，由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将二者分开。
（3）DNA能与二苯胺试剂在常温下反应生成蓝色沉淀。(　　 )
（2）研磨之后，通过过滤或离心，DNA会保留在沉淀物中。( )
（1）DNA不溶于酒精，但一些蛋白质溶于酒精，可利用这一原理初步分离DNA与蛋白质。( )
解析：DNA能与二苯胺试剂在沸水浴下反应，使溶液呈现蓝色，而非蓝色沉淀。
解析：研磨之后，通过过滤或离心，DNA会保留在上清液中。
1.利用新鲜洋葱作为实验材料提取DNA时,说法正确的是（ ）A.可将洋葱置于清水中，细胞吸水破裂后将DNA释放出来B.离心后上清液中加入75%冷酒精，出现的白色丝状物就是纯净的DNAC.将晾干的白色丝状物置于2 ml/L的NaCl溶液中，会发生溶解现象D.可利用DNA在低温下遇到二苯胺试剂呈现蓝色反应的特性对其进行鉴定
2.下列与“DNA的粗提取与鉴定”实验相关的说法，错误的是A.研磨液中应加入DNA酶的抑制剂，以防细胞破碎后DNA酶降解DNAB.研磨时需要控制好时间，以防影响DNA的提取量C.鉴定时加入二苯胺试剂后沸水浴即可观察到较为明显的显色反应D.鉴定时溶液蓝色的深浅与DNA含量的多少有关
3.如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，回答下列问题：
(1)右述图示中，该实验的正确操作顺序是__________________________ (用序号与箭头表示)。(2)步骤④中使用2 ml/L NaCl溶液的目的是 。
(3)步骤①的目的是 ，其依据的原理是 。
(4)步骤①中所得到的丝状物为 色，若要鉴定其主要成分为DNA，可滴加 试剂， 后，如果出现 则证明该丝状物的主要成分为DNA。