5年（2021-2025）高考1年模拟生物真题分类汇编专题09 生物技术与工程（解析版）（广东专用）

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考点01 发酵工程
1、（2023·广东-10）研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线（如图）和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是（ ）

A. a点时取样、尿素氮源培养基
B. b点时取样、角蛋白氮源培养基
C. b点时取样、蛋白胨氮源培养基
D. c点时取样、角蛋白氮源培养基
【答案】D
【解析】
【分析】筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，要用角蛋白氮源培养基。
【详解】研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以在c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，所以D正确，ABC错误。
故选D。
2、（2022·广东-选考21）研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。
回答下列问题：
（1）研究者先制备富集培养基，然后采用________________法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养物，除了稀释涂布平板法，还可采用________________法。据图分析，拟杆菌新菌株在以________________为碳源时生长状况最好。
（2）研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是________________。（答一点即可）
（3）藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是________________。
（4）深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有________________。
【答案】（1） ①. 高压蒸汽灭菌 ②. 平板划线 ③. 纤维素
（2）某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活）
（3）拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行 （4） 耐低温
【解析】
【分析】进行微生物纯种培养物时，人们需要按照微生物对营养物质的不同需求配制培养基；还需要防止杂菌污染，无菌技术主要包括消毒和灭菌。获得微生物纯培养物的常用方法有平板划线法和稀释涂布平板法。
【小问1详解】
培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯净培养物。分析图12可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。
【小问2详解】
深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活），故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。
【小问3详解】
拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。
【小问4详解】
深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性，才能高效降解多糖，保证拟杆菌的正常生命活动所需。
3、（2021·广东-选考21）中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖）为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。
回答下列问题：
（1）为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为___________，并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用___________的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有___________等。（答出两种方法即可）
（2）基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60d以上。该系统不需要灭菌的原因是___________。（答出两点即可）
（3）研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中___________可能是高密度培养的限制因素。
（4）菌株H还能通过分解餐厨垃圾（主要含蛋白质、淀粉、油脂等）来生产PHA，说明其能分泌___________。
【答案】 ①. 唯一碳源 ②. 稀释涂布 ③. 诱变育种、基因工程育种 ④. 盐浓度为60g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制 ⑤. 氧气（O2或溶解氧） ⑥. 蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等
【解析】
【分析】微生物的筛选和计数方法：
（1）实验室中微生物的筛选原理实验室筛选：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
（2）微生物常见的接种方法：稀释涂布平板法、平板划线法。
（3）测定微生物数量的方法：①直接计数法：常用显微镜直接技术法，一般适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。②间接计数法：常用稀释平板计数法，平板培养基上长出一个菌落就代表原待测样品中一个微生物个体。
【详解】（1）根据题意分析，该实验的目的是提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，结合微生物的代谢需求，其液体培养基应该以蔗糖作为唯一碳源 。并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用稀释涂布的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。 此外，选育优良菌株的方法还有诱变育种、基因工程育种等。
（2）已知，菌株H具有嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，因此当培养基盐浓度为60g/L，pH为10时，菌株H可正常持续发酵60d以上，而盐浓度为60g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制，故该系统不需要灭菌。
（3）分析题意，扩大培养时，营养物浓度、温度、pH等条件下适宜，而发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中氧气不足，使菌种进行无氧呼吸产生乙醇，即氧气（O2或溶解氧）是限制高密度培养的重要因素。
（4）根据酶的专一性可知，菌株H之所以能通过分解主要含蛋白质、淀粉、油脂等的餐厨垃圾来生产PHA，说明其能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。
【点睛】本题考查微生物分离和计数的相关知识，意在考查考生运用所学知识解决实际问题的能力，难度适中。
考点02 基因工程
1、（2025·广东-7）Slexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（ ）
A. 1'-碱基B. 2'-氢C. 3'-羟基D. 5'-磷酸基团
【答案】C
【解析】
【分析】在DNA复制过程中，在DNA聚合酶的催化作用下，将一个个的脱氧核苷酸连接形成磷酸二酯键，使子链延伸，但是DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′。
【详解】已知DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′，原因是脱氧核苷酸的3'碳有羟基，可以结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3'-羟基，使其不能结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，C正确。
故选C。
2、（2024·广东-4）关于技术进步与科学发现之间的促进关系，下列叙述正确的是（ ）
A. 电子显微镜的发明促进细胞学说的提出
B. 差速离心法的应用促进对细胞器的认识
C. 光合作用的解析促进花期控制技术的成熟
D. RNA聚合酶的发现促进PCR技术的发明
【答案】B
【解析】
【分析】差速离心法可以通过不同离心速度将细胞内大小、密度不同的细胞器分离开来，使得科学家能够单独对各种细胞器进行研究和分析，从而极大地促进了对细胞器的结构、功能等方面的认识。像线粒体、叶绿体、内质网等细胞器的详细研究，都得益于差速离心法的应用。
【详解】A、电子显微镜的发明是在细胞学说提出之后，细胞学说的提出主要基于光学显微镜的观察和研究，A 错误；
B、差速离心法可以通过不同的离心速度将细胞内大小、密度不同的细胞器分离开来，促进对细胞器的认识，B正确；
C、 光合作用的解析主要是对植物的光合作用机制进行研究，而花期控制技术更多地涉及到植物激素、环境因素等方面的知识，光合作用的解析与花期控制技术的成熟关系不大，C 错误；
D、 PCR 技术的发明并非直接由于 RNA 聚合酶的发现，PCR 技术的关键在于热稳定的 DNA 聚合酶的应用，D 错误。
故选B。
3、（2022·广东-12）λ噬菌体的线性双链DNA两端各有一段单链序列。这种噬菌体在侵染大肠杆菌后其DNA会自连环化（如图），该线性分子两端能够相连的主要原因是（ ）
A. 单链序列脱氧核苷酸数量相等
B. 分子骨架同为脱氧核糖与磷酸
C. 单链序列的碱基能够互补配对
D. 自连环化后两条单链方向相同
【答案】C
【解析】
【分析】双链DNA的两条单链方向相反，脱氧核糖与磷酸交替连接构成DNA分子的基本骨架，两条单链之间的碱基互补配对。
【详解】AB、单链序列脱氧核苷酸数量相等、分子骨架同为脱氧核糖与磷酸交替连接，不能决定该线性DNA分子两端能够相连，AB错误；
C、据图可知，单链序列的碱基能够互补配对，决定该线性DNA分子两端能够相连，C正确；
D、DNA的两条链是反向的，因此自连环化后两条单链方向相反，D错误。
故选C。
4、（2025·广东-21）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题：
（1）研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及______检测，筛选获得重组菌株W1。
（2）将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有______（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是________。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是________。
（3）研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为________。
（4）莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：______。
【答案】（1）琼脂糖凝胶电泳
（2） ①. 稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 ②. 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 ③. PGr在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解 （3）先上升后保持稳定
（4）应用质粒①导入酶B，质粒②导入酶A
【解析】
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。
3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
【小问1详解】
在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，还有核酸分子杂交（或DNA - DNA分子杂交、DNA - RNA分子杂交、抗原-抗体杂交 ）。核酸分子杂交可以检测目的基因是否导入受体细胞以及是否转录，抗原-抗体杂交可以检测目的基因是否表达出相应的蛋白质。
【小问2详解】
检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法（通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量，进而得到细胞密度）、显微镜直接计数法（利用血细胞计数板在显微镜下直接对细胞进行计数）。接种前检测液体培养基的荧光强度，是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰，作为空白对照。进入生长稳定期后，由于PGr在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。
【小问3详解】
在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在培养初期，细胞处于快速生长阶段，随着细胞数量的增加，阻遏蛋白X的量相对不足，PX启动子可能会有一定程度的启动，从而合成mKate2，使荧光强度上升；随着培养的进行，阻遏蛋白X的量逐渐增多，对PX启动子的阻遏作用增强，转录受到抑制，荧光强度保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为先上升后保持稳定。
【小问4详解】
为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，需满足以下条件：条件1：为了保证细胞正常生长，必须保证酶A和酶B都正常。条件2：为了在稳定期有大量莽草酸，需要使酶A增加酶B减少。条件3：质粒①生长期无明显差异稳定期下降，质粒②生长期无明显差异稳定期不变。因此，应用质粒①导入酶B，质粒②导入酶A。
5、（2024·广东-21）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。
回答下列问题：
（1）研究者优化了培养基_______（答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。
（2）研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为________，理由是___________。
（3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为________________________（答两点）。
（4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____。
（5）有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路______。
【答案】（1）碳源、氮源、无机盐
（2） ①. PT7、PBAD 和PBAD ②. 启动子②和③选用 PBAD可以使工程菌无论有、无蓝光 照射都可表达无活性的T7RNAP，在蓝光照射后，无活性的 T7RNAP 转变为有活性的T7RNAP，与特异性启动子P7识别结合并转录基因1，即可用蓝光控制酪氨酸酶的表达
（3）杀死不含光控表达载体的杂菌，避免杂菌污染；筛选出含光控表达载体的工程菌
（4）蓝光诱导酪氨酸酶基因的表达，酪氨酸酶催化酪氨酸转化为黑色素，蓝光照射不到的部位酪氨酸酶不表达
（5）将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问1详解】
培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。
【小问2详解】
题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。
【小问3详解】
光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，可杀死不含光控表达载体的杂菌，避免杂菌污染；筛选出含光控表达载体的工程菌。
【小问4详解】
由小问2分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。蓝光照射不到的部位酪氨酸酶不表达。
【小问5详解】
由小问2分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。
6、（2023·广东-20）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
（1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。
（2）用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备_________。
（3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。

①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株_________（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑_________。

【答案】（1）野生型 （2） ①. 载体（基因表达载体） ②. 启动子和终止子
（3） ①. DAI基因和卡那霉素抗性基因 ②. 75 ③. 自交 ④. 100 ⑤.
【解析】
【分析】1、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换；基因突变发生的时间主要是细胞分裂的间期；基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【小问1详解】
根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
【小问2详解】
利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。
【小问3详解】
①根据题干信息和图形分析，将T0代植株花序浸没在农杆菌（T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因）液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。
②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：
。
7、（2022·广东-选考22）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
（1）研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对________________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
（2）研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是________________，终止子的作用是________________。
（3）培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
（4）这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
【答案】（1）引物 （2） ①. 作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞 ②. 终止转录，使转录在需要的地方停下来
（3）酶蛋白大量表达需要消耗大量能量，而厌氧代谢供能不足
（4） ①. 工业废气资源化 ②. 通过捕获二氧化 碳，实现固碳减排
【解析】
【分析】（1）PCR技术的原理是DNA半保留复制，是在体外大量复制DNA的技术，该技术的关键是Taq酶可以从引物的3’端延伸子链。
（2）减缓温室效应，一方面要减少二氧化碳的排放，另一方面通过植树造林等手段增加大气中二氧化碳的消耗。
【小问1详解】
利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，Taq酶才能从引物的3’端延伸子链。
【小问2详解】
基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。
【小问3详解】
重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，需要消耗大量能量，而厌氧代谢供能不足，所以会导致生长迟缓。
【小问4详解】
根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了工业废气资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程通过捕获二氧化 碳，实现固碳减排，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
8、（2021·广东-选考22）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有___________。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有___________。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备___________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有___________。
（4）依图所示流程，在一定温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是___________。在分子水平上，可以通过改变___________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【答案】 ①. 基因文库中获取、人工合成法 ②. 盐析法、酶解法或高温变性 ③. 感受态 ④. 抗原-抗体杂交技术 ⑤. 有的酶失活而使反应中断 ⑥. 基因的碱基序列
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其 易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因（目的基因）成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术进行检测。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【点睛】本题考查基因工程、DNA的粗提取和鉴定的相关知识，意在考查考生把握知识间的联系、理论与实际相结合解决实际问题的能力，难度中等。
考点03 细胞工程
1、（2025·广东-5）将人眼睑成纤维细胞传代培养后，再培养形成支架，在该支架上接种人口腔黏膜上皮细胞，培养一段时间后分离获得上皮细胞片层，可用于人工角膜的研究。上述过程不涉及（ ）
A. 制备细胞悬液
B. 置于等适宜条件下培养
C. 离心收集细胞
D. 用胰蛋白酶消化支架后分离片层
【答案】D
【解析】
【分析】动物细胞培养条件：（1）无菌、无毒的环境：①消毒、灭菌②添加一定量的抗生素③定期更换培养液，以清除代谢废物。（2）营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质。（3）温度和pH：哺乳动物多以36.5℃为宜，最适pH为7.2-7.4。（4）气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的pH。）
【详解】A、动物细胞培养时，为增大细胞与培养液的接触面积，需要制备细胞悬液，A正确；
B、置于等适宜条件下培养，其中5%的CO2可维持培养液的pH，B正确；
C、在成纤维细胞传代培养过程中需要通过离心收集细胞，C正确；
D、不用胰蛋白酶消化支架，避免将上皮细胞片层分离成单独细胞，D错误。
故选D。
2、（2023·广东-5）人参皂苷是人参的主要活性成分。科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合，以提高人参皂苷的产率。下列叙述错误的是（ ）
A. 细胞融合前应去除细胞壁
B. 高Ca2+—高pH溶液可促进细胞融合
C. 融合的细胞即为杂交细胞
D. 杂交细胞可能具有生长快速的优势
【答案】C
【解析】
【分析】植物体细胞杂交技术：就是将不同种的植物体细胞原生质体在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术。
【详解】A、在细胞融合前，必须先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，再诱导原生质体融合，A正确；
B、人工诱导原生质体融合有物理法和化学法，用高Ca2+—高pH溶液可促进细胞融合，B正确；
C、融合的细胞中有人参根-人参根细胞、人参根-胡萝卜根细胞、胡萝卜根-胡萝卜根细胞，只有人参根-胡萝卜根细胞才是杂交细胞，C错误；
D、杂交细胞含两种细胞的遗传物质，可能具有生长快速的优势，D正确。
故选C。
考点04 胚胎工程
1、（2023·广东3）科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎，并将其移植到长角羚羊体内，使后者成功妊娠并产仔，该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及的操作是（ ）
A. 超数排卵B. 精子获能处理
C. 细胞核移植D. 胚胎培养
【答案】C
【解析】
【分析】体外受精主要包括：卵母细胞的采集和培养、精子的采集和获能、受精。
（1）卵母细胞的采集和培养①主要方法是：用促性腺激素处理，使其超数排卵，然后，从输卵管中冲取卵子。②第二种方法：从已屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞或直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。
（2）精子的采集和获能①收集精子的方法：假阴道法、手握法和电刺激法；②对精子进行获能处理：包括培养法和化学诱导法。
（3）受精：在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。
【详解】由题干信息可知，该过程通过体外受精获得胚胎，再通过胚胎移植，使长角羚羊成功妊娠并产仔，因此需要进行超数排卵、精子获能处理，并对获得的受精卵进行胚胎培养；由于该过程为有性生殖，因此不需要涉及细胞核移植，所以C正确、ABD错误。
故选C。
一、单选题
1．（2025·广东广州·三模）生产L-谷氨酸主要依赖有氧发酵，常用菌种谷氨酸棒状杆菌大多为生物素合成缺陷型。在各组发酵罐中分别添加不同浓度的生物素，检测结果如下图。下列叙述错误的是（ ）
A．发酵前用平板划线法进行谷氨酸棒状杆菌的纯培养
B．发酵过程将空气直接通入发酵罐以保证有氧条件
C．可在添加0.5μg/L生物素发酵32h的条件下大规模生产
D．乙~丁组L-谷氨酸产量不与菌体细胞密度呈正比
【答案】B
【分析】微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基，通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。
（2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
【详解】A、平板划线法是微生物纯培养的常用方法之一，发酵前可以用平板划线法进行谷氨酸棒状杆菌的纯培养，A正确；
B、发酵过程不能将空气直接通入发酵罐，因为空气中可能含有杂菌等，会污染发酵液，应该对通入的空气进行过滤等处理后再通入发酵罐，B错误；
C、从图中可以看出，在添加0.5ug/L生物素发酵32h时，L-谷氨酸产量较高，所以可在该条件下大规模生产，C正确；
D、观察右图和左图，对比乙 - 丁组菌体细胞密度和 L - 谷氨酸产量的变化趋势，发现 L - 谷氨酸产量并不随着菌体细胞密度的增加而一直增加，即乙 - 丁组 L - 谷氨酸产量不与菌体细胞密度呈正比，D正确。
故选B。
2．（2025·广东·模拟预测）某同学用马铃薯琼脂培养基进行酵母菌纯培养，获得甲、乙两个长满菌落的平板。下列叙述正确的是（ ）

A．用接种环在培养基表面划线时需要转动培养皿
B．甲组平板分2个区划线，而乙组分3个区划线
C．从甲、乙两组平板都能分离出酵母菌的单菌落
D．只根据单菌落的大小可反映出酵母菌种类的差异
【答案】C
【分析】微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】A、用接种环在培养基表面划线时不需要转动培养皿，A错误；
B、甲、乙两组平板都分3个区划线，B错误；
C、甲、乙两组平板都出现了酵母菌单菌落，因此从甲、乙两组平板都能分离出酵母菌的单菌落，C正确；
D、根据单菌落的形状、颜色等特征反映菌种种类差异，不能根据菌落的大小，D错误。
故选C。
3．（2025·广东广州·二模）研究人员以YMA培养基(10g甘露醇(H)、0.4酵母粉、0.5gK2H2PO4、0.1gNaCl、0.2gMgSO47H2O,定容至1L)为基础，探究某种大豆根瘤菌的碳源利用情况，实验结果如图。下列叙述错误的是（ ）

A．添加酵母粉作为氮源，原因可能是根瘤菌在体外培养时固氮能力有所下降
B．实验组需将甘露醇替换为等量的其他碳源，其他条件保持一致
C．测定根瘤菌的数量可以使用显微镜直接计数法
D．实验结果直接证明大豆通过蔗糖的形式向根瘤菌供有机营养
【答案】D
【分析】统计菌落数目的方法：（1）显微镜直接计数法：①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量；②方法：用计数板计数； ③缺点：不能区分死菌与活菌。（2）间接计数法（活菌计数法）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
【详解】A、根瘤菌在自然界中与豆科植物共生时，才能发挥固氮作用，因为根瘤菌都依赖豆科植物为其提供有机物，所以在体外培养时，其固氮能力可能受到抑制或下降，因此需要额外添加酵母粉作为氮源，A正确；
B、本实验为探究大豆根瘤菌对不同碳源的利用情况，实验自变量为碳源的种类，为控制无关变量，保证实验为单一变量，故实验组需将甘露醇替换为等量的其他碳源，其他条件保持一致，B正确；
C、显微镜直接计数法计数是测定培养液中微生物数量的方法之一，故该实验中测定根瘤菌的数量可以使用显微镜直接计数法，C正确；
D、据题干信息和实验结果分析可知，当甘露醇被蔗糖替换后，根瘤菌其相对数量与甘露醇的对照组相当，故实验结果只能说明大豆根瘤菌能利用蔗糖作为碳源进行生长繁殖，不能直接证明大豆在自然条件下通过蔗糖的形式向根瘤菌提供有机营养，D错误。
故选D。
4．（2025·广东佛山·二模）为提高厨余垃圾分解效率，研究人员以厨余垃圾浸出液为培养基（CY），对目标菌株A1、A2、A7和A8进行驯化（通过人工措施使微生物逐步适应某一条件的方法），以制备高活性微生物菌剂。相关实验结果如图所示。下列分析错误的是（ ）
A．CY碳源、氮源丰富，比LB更适合大多数菌株生长
B．可利用稀释涂布平板法对四种菌株进行筛选和计数
C．CY驯化培养可使四种菌株的基因频率发生定向改变
D．从活菌数上评价，A2菌株的驯化效果最显著
【答案】A
【分析】微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】A、结合图示可以看出，驯化前，LB培养基中活菌数目更多，因而该培养基更适合大多数菌株生长，A错误；
B、稀释涂布平板法可获得单菌落，且能用于计数，因此，可利用稀释涂布平板法对四种菌株进行筛选和计数，B正确；
C、CY驯化培养（人工进行选择）可使四种菌株的基因频率发生定向改变，使得菌株更适应CY培养液，C正确；
D、根据图示结果可以看出，A2菌株在驯化后活菌数增加最多，因此，从活菌数上评价，A2菌株的驯化效果最显著，D正确。
故选A。
5．（2025·广东清远·二模）下列相关实验操作正确的是（ ）
A．“酵母菌的纯培养”实验中，可采用煮沸消毒法对培养基进行灭菌
B．“DNA的粗提取与鉴定”实验中，可用预冷的95%酒精溶解DNA
C．“植物组织培养”实验中，外植体接种后光照培养以形成愈伤组织
D．“PCR扩增目的基因”实验中，加入的dNTP可以提供能量和原料
【答案】D
【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
【详解】A、培养基灭菌需要采用高压蒸汽灭菌法，煮沸消毒法不能达到彻底除菌的目的，A错误；
B、DNA不溶于酒精，“DNA的粗提取与鉴定”实验中，可用预冷的95%酒精析出DNA，B错误；
C、“植物组织培养”实验中，外植体接种后避光以形成愈伤组织，C错误；
D、dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)是DNA合成的核心原料，含有高能磷酸键，可以为PCR提供能量，也可以作为DNA合成的原料，D正确。
故选D。
6．（2025·广东·二模）酿酒主要借助酵母菌的发酵作用，可以在家庭进行，也可以实现工业化生产。科研人员进行了关于杂种酵母菌在不同基质中的发酵测试，结果见图，下列叙述错误的是（ ）

A．实验结果表明，酵母菌对蔗糖和淀粉的利用效率相近
B．为提高酒精产量，实验过程应该保持严格的无氧条件
C．家庭酿酒可在糯米中加入适量白砂糖以提高发酵效率
D．家庭酿酒难以严格灭菌，需要通过消毒抑制杂菌生长
【答案】B
【分析】果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。
【详解】A、观察曲线图可知，乙组和丙组在相同时间内酒精相对含量变化趋势相近，说明酵母菌对蔗糖和淀粉的利用效率相近，A正确；
B、酵母菌在有氧条件下进行有氧呼吸大量繁殖，在无氧条件下进行无氧呼吸产生酒精，在发酵前期适当通入氧气让酵母菌大量繁殖，后期保持无氧条件可提高酒精产量，并非整个实验过程都要保持严格无氧条件，B错误；
C、从图中可以看出甲组（含蔗糖）的发酵效果较好，所以家庭酿酒在糯米中加入适量白砂糖（主要成分是蔗糖）能为酵母菌提供更多易利用的碳源，可提高发酵效率，C正确；
D、家庭酿酒难以做到严格灭菌，通过消毒（如对器具清洗、用开水烫等 ）可抑制杂菌生长，保证酿酒顺利进行，D正确。
故选B。
7．（2025·广东深圳·一模）根据现代生物技术原理，为解决以下四个问题，采用的相应技术手段是（ ）
①快速培养名贵花卉②克服远缘植物有性杂交不亲和的障碍③提高农作物的抗病能力④干扰素的工业化生产。
A．AB．BC．CD．D
【答案】C
【分析】1、微型繁殖：快速繁殖优良品种的植物组织培养技术，也叫快速繁殖技术；
2、动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞；
3、植物基因工程的应用：（1）抗虫转基因植物；（2）抗病转基因植物；（3）抗逆转基因植物；（4）转基因改良植物品质。总之基因工程在农业上用于生产高产、稳产和具有优良品质的品种，能产生抗逆性品种。
【详解】①植物组织培养技术可用于快速繁殖优良品种，因此快速培养名贵花卉可采用植物组织培育技术；
②体细胞杂交技术可以克服远缘植物有性杂交不亲和的障碍；
③采用植物基因工程技术可培育抗病转基因植株，因此提高农作物的抗病能力可采用基因工程技术；
④利用微生物的发酵工程可以工业化生产干扰素等药物。
综上所述，解决①快速培养名贵花卉②克服远缘植物有性杂交不亲和的障碍③提高农作物的抗病能力④干扰素的工业化生产这四个问题，采用的相应技术手段是分别是组织培养、植物体细胞杂交、基因工程和发酵工程，因此C正确，ABD错误。
故选C。
8．（2025·广东·一模）下列关于培养技术及应用的叙述，错误的是（ ）
A．采用茎尖组织培养技术培育脱毒草莓
B．可用无机盐、琼脂和石油配制的培养基筛选石油降解菌
C．可用基因组编辑技术进行“设计完美婴儿”生殖性克隆人研究
D．可用PEG诱导骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合成杂交瘤细胞
【答案】C
【分析】现代生物技术的应用中，有许多技术是需要筛选和检测的，如制备单克隆抗体时，需要用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，还需要进行抗体阳性检测得到能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞；植物体细胞杂交过程中，需要筛选出杂种细胞进行组织培养；转基因技术中，需要筛选重组子和检测目的基因是否导入和表达。
【详解】A、植物的茎尖部位病毒极少甚至无病毒，采用茎尖组织培养技术可以培育脱毒草莓，A正确；
B、石油降解菌能利用石油作为碳源，用无机盐、琼脂和石油配制的培养基，只有能分解石油的微生物才能在其上生长，所以可以筛选石油降解菌 ，B正确；
C、“设计完美婴儿”生殖性克隆人研究严重违反人类伦理道德，同时也可能带来一系列的社会、法律和伦理问题，是被严格禁止的，C错误；
D、PEG（聚乙二醇）可以诱导动物细胞融合，所以可用PEG诱导骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合成杂交瘤细胞，D正确。
故选C。
9．（2025·广东广州·一模）陈醋中的川芎嗪是治疗血栓等疾病的新型药物，能活血化瘀并对已聚集的血小板有解离作用。研究人员为提高陈醋药用价值，分别探究了传统、机械生产工艺对川芎嗪含量的影响，结果如下。下列叙述错误的是（ ）
A．陈醋发酵过程中需要提供碳源、氮源并通入空气
B．传统熏醅时提高熏醅的温度可以提高川芎嗪的产量
C．受皮外伤的患者在伤口愈合期间建议减少对陈醋的食用
D．选用机械醋酸发酵和机械熏醅方式酿造的食醋药用价值更高
【答案】B
【分析】参与果醋制作的微生物是醋酸菌，其新陈代谢类型是异养需氧型。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将糖直接分解成醋酸；当氧气充足、缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
【详解】A、陈醋发酵利用的是醋酸菌，其代谢类型是异养需氧型，故发酵过程中需要提供碳源、氮源并通入空气，A正确；
B、根据图表信息不能判断传统熏醅时提高熏醅的温度可以提高川芎嗪的产量，B错误；
C、伤口愈合需要血小板参与，而陈醋中的川芎嗪对已聚集的血小板有解离作用，故受皮外伤的患者在伤口愈合期间建议减少对陈醋的食用，C正确；
D、选用机械醋酸发酵和机械熏醅方式酿造的食醋川芎嗪含量更高，药用价值更高，D正确。
故选B。
10．（2025·广东珠海·模拟预测）一粒小麦（2N=14）和斯氏山羊草（2N=14）是近缘物种，是进行细胞生物学研究的良好材料，下图是科研人员在实验室中进行相关研究的流程图，A和B分别表示一个染色体组。下列相关叙述错误的是（ ）

A．经有性杂交所得植株1为不育异源二倍体
B．种子发育为植株1能体现细胞的全能性
C．图示两途径获得的植株2和3基因型相同
D．植物原生质体融合说明细胞膜具有流动性
【答案】B
【分析】分析题图：得到植株3运用了植物体细胞杂交技术，得到植株2运用了多倍体育种技术，得到植株1运用的是杂交的方法。
【详解】A、一粒小麦（AA）和斯氏山羊草（BB）经有性杂交，所得植株1的染色体组成为AB。因为A和B是不同的染色体组，植株1减数分裂时染色体联会紊乱，不能产生正常配子，所以是不育异源二倍体，A正确；
B、种子发育为植株1，种子中的胚是由受精卵发育而来，胚是新植物的幼体，由胚种子发育为植株1不能体现细胞的全能性，B错误；
C、植株2是由AB的种子经秋水仙素处理后得到，染色体加倍，基因型为AABB；植株3是由AA和BB原生质体融合得到，基因型也是AABB，二者基因型相同，C正确；
D、植物原生质体融合过程中，不同细胞的细胞膜相互融合，说明细胞膜具有流动性，D正确。
故选B。
11．（2025·广东湛江·模拟预测）杂交技术在生物学上应用广泛，包括个体水平、细胞水平和分子水平都可以运用杂交。下列叙述正确的是（ ）
A．生产中培育香蕉脱毒苗常用植物体细胞杂交技术
B．构建特定疾病模型的动物可用动物细胞杂交瘤技术
C．抗原—抗体杂交可检测目的基因是否转录出了mRNA
D．DNA分子杂交技术可以用来比较不同种生物DNA分子的差异
【答案】D
【分析】植物组织培养就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。
【详解】A、生产中培育香蕉脱毒苗常用植物组织培养，A错误；
B、动物细胞杂交瘤技术用于制备单克隆抗体，B错误；
C、抗原—抗体杂交用于检测目的基因是否表达出蛋白质，C错误；
D、DNA分子杂交通过碱基配对可检测不同生物DNA分子的差异，D正确。
故选D。
12．（2025·广东惠州·一模）竹子与水稻同为禾本科不同亚科植物，染色体都是2N＝24，但亲和性非常差。我省梅州市农艺师钟章美历经40多年，成功将竹子与水稻进行超远缘有性杂交，培育出了高产、优质的新品种竹稻F，其培育过程如下图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．①过程得到中间材料稻C的原理为染色体变异
B．理论上可以用植物体细胞杂交技术获得竹稻F
C．竹稻F自交能获得后代，说明竹子和水稻无生殖隔离
D．通过③过程得到竹稻F可稳定遗传，属于二倍体
【答案】B
【分析】多倍体育种：原理：染色体变异，方法：最常用的是利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗。秋水仙素能抑制有丝分裂时纺缍丝的形成，染色体不能移动，使得已经加倍的染色体无法平均分配，细胞也无法分裂，当秋水仙素的作用解除后，细胞又恢复正常的生长，然后再复制分裂，就能得到染色体数目加倍的细胞。
【详解】A、①过程是籼稻A与粳稻杂交得到稻C，该过程属于有性杂交，原理是基因重组，而不是染色体变异，A错误；
B、植物体细胞杂交技术可以克服远缘杂交不亲和的障碍，竹子和水稻虽然是不同亚科植物，亲缘性非常差，但理论上可以用植物体细胞杂交技术将竹子和水稻的体细胞融合，经过植物组织培养等技术获得竹稻 F，B正确；
C、竹稻 F是在竹稻E染色体加倍后才可育，而竹稻E是不可育的，竹子和水稻是存在生殖隔离的，C错误；
D、③过程使用秋水仙素处理稻E得到竹稻F，秋水仙素能抑制纺锤体的形成，使染色体数目加倍，所以竹稻F属于多倍体（可能是四倍体等），而不是二倍体；并且经过秋水仙素处理后得到的竹稻F是纯合子，能稳定遗传，D错误。
故选B。
13．（2025·广东清远·二模）科学家为解决马铃薯因感染茄科霍尔氏菌导致产量下降问题，利用植物体细胞杂交技术成功获得了茄子融合亲本的青枯病抗性杂种植株。下列相关说法错误的是（ ）
A．混合酶液处理过程需要用纤维素酶和果胶酶混合去除细胞壁
B．过程①可利用聚乙二醇、Ca2+载体等方法诱导原生质体融合
C．过程②成功的标志是融合的原生质体长出新的细胞壁
D．过程③需对获得的杂种植株进行筛选
【答案】B
【分析】植物体细胞杂交是指将两个来自不同种植物的体细胞融合成一个杂种细胞，并将杂种细胞培育成新的植物体技术。
【详解】A、植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，在进行植物体细胞杂交时，需要用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，以获得原生质体，所以混合酶液处理过程需要用纤维素酶和果胶酶除去细胞壁，A正确；
B、过程①是诱导原生质体融合，常用的方法有物理法（离心、振动、电激等）和化学法（聚乙二醇），而Ca2+载体一般用于将目的基因导入微生物细胞（如大肠杆菌）时，使细胞处于感受态，不是诱导原生质体融合的方法，B错误；
C、过程②中融合的原生质体成功的标志是长出新的细胞壁，这意味着杂种细胞已经形成了完整的细胞结构，C正确；
D、过程③是从愈伤组织培育成杂种植株，由于融合过程可能存在多种情况，所以需对获得的杂种植株进行筛选，以得到具有青枯病抗性的杂种植株，D正确。
故选B。
14．（2025·广东湛江·模拟预测）Rag2基因缺陷导致大鼠无法产生B、T淋巴细胞。科研人员将正常大鼠的胚胎干细胞（ES细胞）注射到Rag2基因缺陷大鼠的桑葚胚中，使其产生具有正常ES细胞来源的淋巴细胞群的体细胞嵌合体，从而补充其缺失的淋巴细胞，其过程如图所示。下列分析正确的是（ ）
A．嵌合体大鼠产生的B、T细胞直接由ES细胞分化而来
B．获得的嵌合体大鼠的大部分细胞的Rag2基因没有缺陷
C．注入桑葚胚的ES细胞在囊胚期主要存在于内细胞团
D．该实验最终获得了嵌合体大鼠证明ES细胞具有全能性
【答案】C
【分析】1、胚胎干细胞简称ES细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团）。
2、动物细胞培养的条件：（1）无菌、无毒的环境：①消毒、灭菌；②添加一定量的抗生素；③定期更换培养液，以清除代谢废物。（2）营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质。（3）温度和pH：36.5℃±0.5℃；适宜的pH：7.2～7.4。（4）气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的pH）。
【详解】A、嵌合体大鼠中供体来源的ES细胞可分化形成造血干细胞，再分化成淋巴细胞，A错误；
B、获得的嵌合体大鼠大部分细胞还是有Rag2基因缺陷，只有ES细胞来源的淋巴细胞群没有Rag2基因缺陷，B错误；
C、桑葚胚注入的ES细胞在囊胚期主要存在于内细胞团，内细胞团将来发育成胎儿的各种组织，C正确；
D、该实验获得的嵌合体大鼠是由大鼠胚胎发育而来，并不是ES细胞发育而来，不能体现其全能性，D错误。
故选C。
15．（2025·广东深圳·二模）胞质雄性不育（CMS）是线粒体基因引起的胞质功能混乱现象，表现为花粉不育。经γ射线处理的芜菁细胞（AA，A表示染色体组）和甘蓝细胞（BB，B表示染色体组）融合，可获得CMS甘蓝植株（BB）。下列分析错误的是（ ）
A．芜菁细胞和甘蓝细胞融合前需要去除两者的细胞壁
B．γ射线照射的作用是促进芜菁细胞与甘蓝细胞融合
C．融合后的CMS甘蓝获得了芜菁细胞的细胞质基因
D．植物体细胞杂交技术为培育CMS甘蓝提供一种路径
【答案】B
【分析】植物的体细胞杂交是将不同植物的细胞通过细胞融合技术形成杂种细胞，进而利用植物的组织培养将杂种细胞培育成多倍体的杂种植株。植物体细胞杂交依据的原理是细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。
【详解】A、植物细胞由于有细胞壁的存在不能直接融合，需要用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，A正确；
B、γ射线照射的作用是破坏芜菁细胞的染色质，B错误；
C、两种细胞融合产生的CMS甘蓝植株（BB）只含有甘蓝的染色体组，并且获得了芜菁细胞的细胞质基因，C正确；
D、由题干信息可知，培育CMS甘蓝采用了植物体细胞杂交技术，即植物体细胞杂交技术为培育CMS甘蓝提供一种路径，D正确。
故选B。
16．（2025·广东广州·二模）研究发现，将牛的重构胚的染色体组蛋白上特定位点的甲基化去除，可提高重构胚的发育率和牛体细胞核移植的成功率。下列说法错误的是（ ）
A．可将供体细胞注入去核卵母细胞中形成牛的重构胚
B．向重构胚注入去甲基化酶的mRNA可能有助于胚胎正常发育
C．应将重构胚培养至囊胚或原肠胚后移植入受体母牛子宫
D．推测表观遗传现象是制约体细胞核移植成功的原因之一
【答案】C
【分析】细胞核移植概念：将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。
【详解】A、将供体细胞注入到去核卵母细胞中可形成牛的重构胚，A正确；
B、向重构胚注入去甲基化酶的mRNA，该mRNA可翻译形成去甲基化酶将牛的重构胚的染色体组蛋白上特定位点的甲基化去除，从而有助于胚胎正常发育，B正确；
C、应将重构胚培养至囊胚后移植入受体母牛子宫，原肠胚不能再进行胚胎移植，C错误；
D、染色体组蛋白上特定位点的甲基化去除，可提高重构胚的发育率和牛体细胞核移植的成功率，组蛋白的去甲基化是一种表观遗传，因此推测表观遗传现象是制约体细胞核移植成功的原因之一，D正确。
故选C。
17．（2025·广东广州·模拟预测）研究发现，哺乳动物胎儿发育早期，造血干细胞会大量迁移至胎儿肝脏并增殖分化。肝细胞中Fetua基因控制合成胎球蛋白A，该蛋白能保护造血干细胞基因组稳定性，降低突变概率。下列叙述错误的是（ ）
A．胎儿发育早期，肝脏可产生多种血细胞
B．胎儿早期胚胎细胞与造血干细胞分化程度相同
C．哺乳动物肝细胞和造血干细胞都含Fetua基因
D．Fetua基因表达受阻会增大胎儿免疫功能失调的风险
【答案】B
【分析】1、在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程，叫作细胞分化。
2、干细胞是一类具有自我复制能力及多向分化潜能的细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。
【详解】A、由题干可知，在哺乳动物胎儿发育早期，造血干细胞会大量迁移至胎儿的肝脏发生增殖分化，而免疫细胞是由造血干细胞分化而来的，所以胎儿发育早期，胎儿的肝脏可以产生多种免疫细胞，A正确；
B、造血干细胞是已经分化的细胞，而早期胚胎细胞具有较高的全能性，分化程度较低。造血干细胞与早期胚胎细胞的分化程度是不同的，造血干细胞的分化程度相对较高，B错误；
C、同一个体的体细胞都是由受精卵经有丝分裂和分化形成的，所含的基因相同。哺乳动物的肝细胞和造血干细胞都是体细胞，都含有Fetua基因，C正确；
D、因为胎球蛋白A由Fetua基因控制合成，该蛋白能保护造血干细胞基因组稳定性，降低突变的概率，所以Fetua基因表达受阻，胎球蛋白A不能正常合成，造血干细胞基因组稳定性可能受影响，使免疫细胞的生成受阻，增大胎儿免疫功能失调的风险，D正确。
故选B。
18．（2025·广东广州·模拟预测）为拯救濒危野化单峰骆驼，科研人员利用现代生物技术尝试进行人工培育，流程如图。下列叙述正确的是（ ）
A．过程①中常用促性腺激素处理雌性的驯养单峰骆驼
B．过程②中卵细胞膜和透明带先后发生生理反应阻止多精入卵
C．过程③应选用MⅡ期的卵母细胞，过程④移植的应为原肠胚
D．E后代和F后代的核遗传物质均有部分来自于B
【答案】A
【分析】胚胎工程指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内产生后代，以满足人类的各种需求。
【详解】A、过程①是卵母细胞采集，该过程常用促性腺激素处理B诱导其超数排卵，以便获得更多的卵母细胞，A正确；
B、过程②受精作用过程中先后发生透明带反应和卵细胞膜反应，防止多精入卵，B错误；
C、过程③应选用MⅡ期的卵母细胞，过程④移植的应为桑葚胚或囊胚，C错误；
D、由图示可知，F后代是经过核移植获得的，F后代的核遗传物质只来自于C，D错误。
故选A。
19．（2025·广东湛江·模拟预测）生物学中重要的发现都离不开技术的创新。下列属于我国首先突破的科技成果的是（ ）
①首次人工创建单条染色体的真核细胞
②首次在体外进行DNA改造成功构建体外重组DNA分子
③首台用于全肢体中风康复的脑控人工神经机器人系统
④首次获得世界上第一只体细胞克隆羊
A．①④B．②③C．②④D．①③
【答案】D
【分析】原核细胞：没有被核膜包被的成形的细胞核，没有核膜、核仁和染色质；没有复杂的细胞器（只有核糖体一种细胞器）；只能进行二分裂生殖，属于无性生殖，不遵循孟德尔的遗传定律；含有细胞膜、细胞质，遗传物质是DNA。真核生物：有被核膜包被的成形的细胞核，有核膜、核仁和染色质；有复杂的细胞器（包括线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、核糖体等）；能进行有丝分裂、无丝分裂和减数分裂；含有细胞膜、细胞质，遗传物质是DNA。
【详解】①2018年我国科学家在国际上首次人工创建单条染色体的真核酿酒酵母细胞，①正确；
②首次在体外进行DNA改造成功构建体外重组DNA分子是美国，②错误；
③2014年全球首台用于全肢体中风康复的脑控人工神经机器人系统“神工一号”在我国问世，③正确；
④首次获得世界上第一只体细胞克隆羊是英国，④错误。
所以是①③，D正确。
故选D。
20．（2025·广东佛山·二模）生物工程技术发展常常受到自然发生的生物学过程启示。下列对应关系错误的是（ ）
A．AB．BC．CD．D
【答案】D
【分析】植物的体细胞杂交是将不同植物的细胞通过细胞融合技术形成杂种细胞，进而利用植物的组织培养将杂种细胞培育成多倍体的杂种植株。
【详解】A、S型肺炎链球菌的遗传物质DNA可以进入R型菌内并使R型菌转化为S型菌，基因工程就是将人们所需要的目的基因导入到受体细胞中稳定高效表达，因此基因工程受到了肺炎链球菌的转化的启示，A正确；
B、细胞中的DNA可以进行复制，在体外给予适宜的条件也可以进行DNA复制，PCR就是体外DNA复制的过程，B正确；
C、同卵双胞胎就是来源于同一个胚胎，胚胎分割技术就是将早期胚胎进行胰酶处理或机械切割，最终经过培养获得多个后代，C正确；
D、植物的体细胞杂交是将不同植物的细胞通过细胞融合技术形成杂种细胞，进而利用植物的组织培养将杂种细胞培育成多倍体的杂种植株，可以实现跨物种间的遗传物质的交流，该技术为无性繁殖，亲缘关系近的植物杂交是有性生殖，D错误。
故选D。
21．（2025·广东广州·二模）紫外线主要通过诱导DNA/链中相邻的胸腺嘧啶形成嘧啶二聚体而损伤DNA。DNA复制时，嘧啶二聚体无法作模板，子链在此处随机引入碱基后再进行延伸，导致发生突变，严重时会导致细胞死亡。生物进化过程中形成了多种修复机制，图示大肠杆菌两种常见的修复嘧啶二聚体机制，其中光解酶需可见光提供能量。在某DNA损伤只形成一个嘧啶二聚体的前提下，下列叙述错误的是（ ）
A．若该损伤的DNA分子未发生修复，复制时无法形成碱基序列正常的DNA
B．DNA修复机制的存在使大肠杆菌发生基因突变的频率下降
C．依赖内切酶、外切酶的DNA修复过程还需DNA连接酶等的参与
D．用紫外线进行消毒后保持黑暗一段时间，有利于提高消毒效果
【答案】A
【分析】图中是DNA修复过程，左侧是利用光解酶将嘧啶二聚体解开，而右侧是利用内切酶和外切酶将嘧啶二聚体剪切掉，并利用碱基互补配对修复正确。
【详解】A、根据题意可知，DNA复制时，嘧啶二聚体无法作模板，子链在此处随机引入碱基后再进行延伸，导致发生突变，因此如果DNA损伤未修复，复制时会随机引入碱基，导致突变，但由于DNA复制时两条链都可以作为模板，另一条链上的碱基序列是正常的，可通过DNA复制形成正常的DNA序列，A错误；
B、DNA修复机制可以修复损伤，减少突变的发生，从而降低基因突变的频率，B正确；
C、DNA修复过程中，内切酶和外切酶负责切除损伤部分，DNA连接酶负责连接修复后的DNA片段，C正确；
D、光解酶需可见光提供能量来修复嘧啶二聚体，用紫外线进行消毒后保持黑暗一段时间，光解酶无法发挥作用，不能修复被紫外线损伤的DNA，从而使DNA受损，因此有利于提高消毒效果，D正确。
故选A。
二、实验题
22．（2025·广东惠州·一模）科学家们正在开发一种混有枯草芽孢杆菌孢子的新型复合塑料，该孢子能耐受塑料生产工艺中的高温热熔条件。废弃复合塑料内的孢子在特定条件下能萌发产生大量枯草芽孢杆菌，从而有效分解塑料。回答下列问题：
(1)在实验室中培养枯草芽孢杆菌时，可根据菌落的 将它与其他微生物初步区分开，再将接种有枯草芽孢杆菌的培养基置于 条件下培养来筛选所需的菌株。
(2)适应性实验室进化（ALE）是指通过模拟自然选择过程，在实验室中对微生物进行长期培养和筛选，使其逐渐适应特定环境条件。与其相比，利用基因工程直接改造微生物的优点是 。
(3)科学家对经过ALE处理的孢子进行了全基因组测序，发现fusA突变和abrB突变均能够显著提高孢子的耐热性。为了进一步探究这两种突变对提高孢子耐热性是否存在协同效应，请写出相关实验设计思路： 。
(4)科学家将表面蛋白基因ctB与绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，导入耐热孢子形成的菌株中表达出融合蛋白，从而使绿色荧光能锚定在细胞表面显示材料中孢子的萌发状态。下图中最适合的表达载体是 ，判断理由是 。
(5)未来若将该技术应用于生产实践中，还需考虑哪些具体问题： （回答1点即可）。
【答案】(1) 形态特征 适宜的温度
(2)定向改造微生物的遗传特性
(3)构建同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，与仅有fusA突变或仅具有abrB突变的菌株进行比较，观察耐热性表现
(4) 甲 乙中TAG对应终止密码，会导致翻译完ctB蛋白后不能继续翻译gfp蛋白
(5)确保孢子在不同环境条件下的稳定性和活性
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）在实验室中培养枯草芽孢杆菌时，可根据菌落的形态特征将它与其他微生物初步区分开，再将接种有枯草芽孢杆菌的培养基置于适宜的温度下培养来筛选所需的菌株。
（2）适应性实验室进化（ALE）是指通过模拟自然选择过程，在实验室中对微生物进行长期培养和筛选，使其逐渐适应特定环境条件。与其相比，利用基因工程可定向改造微生物的遗传特性，比如需要微生物具有耐寒的性质，可以通过基因工程将耐寒的基因导入微生物。
（3）该实验的目的是fusA突变和abrB突变对提高孢子耐热性是否存在协同效应，因此要构建同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，可将实验分为三组，甲组fusA突变的菌株，乙组abrB突变的菌株，丙组同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，将三组菌株放到高温环境下培养一段（相同）时间，观察三组菌株的耐热性表现，若丙组菌株的耐热性大于甲和乙，则说明fusA突变和abrB突变对提高孢子耐热性存在协同效应，反之不行。
（4）根据题意分析，表面蛋白基因ctB与绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，需去除ctB基因中编码终止密码的序列，导入耐热孢子形成的菌株中才能表达出融合蛋白，乙中的TAG编码终止密码，会使翻译完ctB蛋白后不能继续翻译gfp蛋白。
（5）未来若将该技术应用于生产实践中，需要考虑孢子在不同环境条件下的稳定性和活性
23．（2025·广东湛江·二模）研究人员利用基因工程的方法将油料作物紫苏的二酰甘油酰基转移酶（DGAT1）基因导入四尾栅藻（操作过程如图），获得转基因的高产油脂四尾栅藻。利用地热废水培养该藻，在生产生物柴油的同时，还能治理地热废水。请回答下列问题：
注：lacZ基因编码产物在X-gal和IPTG存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。
(1)为保证从紫苏细胞中获得的DGAT1基因与pMD19克隆质粒相连，可在设计PCR所用引物时，在引物的 端加上特定限制酶的识别序列。第一次转化的受体细胞是大肠杆菌，结合该细胞的特点说明这样做的目的是 。
(2)经转化的大肠杆菌可通过 （方法）接种到培养基上继续培养。为筛选目标菌株，培养基应加入的成分有 。在该培养基中，目标菌株的菌落呈 色。
(3)启动子往往具有物种特异性，在载体pBI121质粒中插入紫苏DCAT1基因，其上游启动子应选择 （填“紫苏DGAT1基因”、“大肠杆菌”或“四尾栅藻”）的启动子。
(4)为检测转基因四尾栅藻对地热废水的治理能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表。该实验不能说明转DGAT1基因显著提高了四尾栅藻的去污能力。请进一步完善实验设计： 。
表培养转基因四尾栅蕴的地热废水培养基各项指标测定结果
【答案】(1) 5′ 大肠杆菌繁殖速度快，利用克隆载体随着细菌分裂而大量复制，得到充足的目的基因（或是利用结构简单的大肠杆菌构建基因文库，实现目的基因的长期保存）
(2) 稀释涂布平板法 氨苄青霉素、X-gal、IPTG 白色
(3)四尾栅藻
(4)应添加对照组：用相同废水培养基培养等量非转基因四尾栅藻（其余条件相同），11天后检测对照组总氮、总磷和氟化物的含量并与实验组进行比较
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）为保证从紫苏细胞中获得的DGAT1基因与pMD19克隆质粒相连，需保证目的基因与质粒有相同的末端，DNA复制时从引物的3'开始，所以可以在引物的5′端加上特定的限制酶识别序列，然后用限制酶切割目的基因和质粒。利用大肠杆菌的快速复制能力，可低成本、快速地扩增目的基因。同时，将目的基因与克隆载体连接导入到大肠杆菌，将菌种冻存可实现重组质粒的长期保存，以便长期保存目的基因，保证后续实验有充足的目的基因。
（2）转化后的大肠杆菌用稀释涂布平板法接种于培养基表面以便获得单菌落，为了筛选成功导入重组载体的大肠杆菌，应在培养基中添加氨苄青霉素、X-gal、IPTG。据图分析可知，目的基因转入的位置是在lacZ基因内，因此转入重组载体的大肠杆菌在选择培养基上的菌落呈白色。
（3）由于启动子具有物种特异性，载体pBI121质粒是要转入四尾栅藻中保证目的基因能成功表达，因此需选择在四尾栅藻细胞中的启动子。
（4）要想证明转DGAT1基因显著提高了四尾栅藻的去污能力，应增加非转基因四尾栅藻对废水的去污能力，将转基因四尾栅藻与非转基因组结果进行比较，应添加对照组：废水培养非转基因四尾栅藻11天后，检测总氮、总磷和氟化物的含量。
24．（2025·广东·模拟预测）高粱是重要的粮食和经济作物。为加速其遗传改良进程，科研人员进行了一系列研究。
(1)目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内 的过程称为转化。已有研究发现，过表达植物发育调节因子（WUS、BBM、GRF、GIF等）可有效提高转化效率。
(2)科研人员欲利用上述四种调节因子加速高粱的遗传改良，构建了如图所示的三种基因表达载体，其中LB和RB分别是T-DNA的左右边界，DsRed和NPTH作为 用于筛选转化成功的受体细胞。GIF是GRF的辅助因子，从蛋白质结构和功能角度推测GRF-GIF以融合基因的形式插入的意义是 。
(3)将三种载体分别导入高粱胚中，统计结果如表。
①转化效率的计算公式为 。
②结果显示WUS+BBM的存活率高而转化效率低，GRF-GIF则相反。对此合理的解释是 。
③观察3月龄植物生长状况，发现WUS+BBM会造成叶片扭曲、生育能力降低等生长缺陷，而GRF-GIF与对照组相比没有明显差异，说明 。
【答案】(1)维持稳定和表达
(2) 标记基因 融合基因表达产物是GIF﹣GRF融合蛋白，GIF已与GRF结合，可更好发挥作用
(3) 带芽的愈伤组织÷胚×100% WUS+BBM促进脱分化，GRF﹣GIF促进愈伤组织再分化 GRF﹣GIF比WUS+BBM能更好地加速高粱的遗传改良
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化，转化不仅仅是目的基因的进入和稳定存在，还包括其在受体细胞内的表达。
（2）据题干信息“DsRed是红色荧光基因，NPTH是新霉素抗性基因”可知，DsRed和NPTⅡ作为标记基因，可用于筛选转化成功的受体细胞；已知GIF是GRF的辅助因子，GRF-GIF以融合基因形式插入可以确保融合基因表达产物是GIF﹣GRF融合蛋白，GIF已与GRF结合，可更好发挥作用。
（3）①分析题意，将三种载体分别导入高粱胚中，据表中数据可知，转化效率的计算公式为（带芽的愈伤组织数量 / 胚的数量）× 100%。
②分析表格数据可知，WUS+BBM的存活率高而转化效率低，GRF-GIF则相反，说明外源基因的转化和表达可能会对原有基因的功能造成不同程度的影响：WUS+BBM促进脱分化，GRF﹣GIF促进愈伤组织再分化。
③观察3月龄植物生长状况，发现WUS+BBM会造成叶片扭曲、生育能力降低等生长缺陷，而GRF-GIF与对照组相比没有明显差异，说明GRF-GIF嵌合蛋白在提高转化效率的同时，不会对植株的正常生长和发育产生明显的负面影响，而WUS+BBM的表达则可能导致植株生长异常，故GRF﹣GIF比WUS+BBM能更好地加速高粱的遗传改良。
25．（2025·广东深圳·二模）噬菌体表面展示技术是一种基因工程技术，通过将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因中，使外源蛋白以融合蛋白形式表达在噬菌体表面，这种技术可用于筛选高亲和力抗体。丝状噬菌体呈细长管状，由衣壳蛋白和DNA组成，衣壳蛋白中有一类衣壳蛋白III（PIII）与噬菌体感染有关。回答下列问题：
(1)研究人员将EcRI基因和PIII基因融合进行表面展示，过程如图。首先将EcRI基因插入PIII基因中；再将重组噬菌体DNA成功导入 进行培养，获得子代重组噬菌体；为检测EcRI蛋白是否成功展示在重组噬菌体表面，可采用 对重组噬菌体进行检测。
(2)根据噬菌体表面展示技术的目的，推测展示在噬菌体表面的EcRI蛋白 （填“会”或“不会”）影响重组噬菌体的感染过程。为证明该推测，研究人员设计如下表实验并检测感染能力。根据以上信息，完成下列表格。
注：“-”表示未添加，“+”表示添加
(3)抗体的结构包含VH和VL。研究人员从抗原phOx免疫的小鼠脾脏中提取mRNA，经 过程获得VH和VL的cDNA。将一系列VH和VL的cDNA随机两两组合后，插入PIII基因，构建出2×105种噬菌体克隆作为文库。从文库中选择568种噬菌体进行检测后发现，能与抗原phOx结合的噬菌体极少，若实验操作没有问题，则表明该噬菌体文库中 。
(4)研究人员将抗原phOx附着在特定基质上，将噬菌体文库中的噬菌体通过基质，并进行多次重复，每次重复时减少基质上抗原phOx的密度，推测多次重复的意义 。
【答案】(1) 大肠杆菌（细菌） 抗原-抗体杂交
(2) 不会 抗EcRI的抗体 强
(3) 逆转录 该文库中有抗原phOx亲和力的噬菌体比例过低
(4)随着基质上抗原的密度不断减少，能结合的噬菌体亲和力越来越高，有利于筛选出亲和力更高的抗体
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）噬菌体可以侵染大肠杆菌，可将重组噬菌体DNA成功导入大肠杆菌（细菌）；抗原-抗体杂交可以检测抗体，可采用抗原-抗体杂交对重组噬菌体进行检测。
（2）对照组1和对照组3均含过量游离的EcRI蛋白，感染能力均较强，因此推测展示在噬菌体表面的EcRI蛋白不会影响重组噬菌体的感染过程；检测各组的EcRI蛋白，利用抗原-抗体杂交，需要加入抗EcRI的抗体；对照组2为野生型噬菌体，感染能力强。
（3）逆转录以mRNA为模板，可以获得cDNA；该文库中有抗原phOx亲和力的噬菌体比例过低，因此选择568种噬菌体进行检测后发现，能与抗原phOx结合的噬菌体极少。
（4）随着基质上抗原的密度不断减少，能结合的噬菌体亲和力越来越高，有利于筛选出亲和力更高的抗体，每次重复时减少基质上抗原phOx的密度。
26．（2025·广东广州·二模）不同的启动子活性不同，可引起基因表达强度的差异。MCS是一段含多种限制酶切割位点的DNA序列，广泛用于插入不同外源启动子，但MCS自身序列也可能会启动下游基因的表达，对外源启动子活性检测造成干扰。为了构建能灵敏检测外源启动子活性的质粒，科研人员利用无启动子的lacZ基因和质粒p构建出质粒p-lacZ(如图甲)，并以此进行进一步研究。回答下列问题。

(1)为构建更为灵敏的外源启动子活性检测质粒，最好选择限制酶 切割质粒p-lacZ,然后将MCS与p-lacZ连接构建成质粒p01。在此基础上对MCS列进行不同改造分别得到质粒p02、p03、p04、p05、p06。
(2)将质粒p01~p06分别与lacZ基因缺失菌株混合后接种至含 的液体培养基中培养并筛选出成功转入质粒的菌株，然后分别于28℃和37℃条件下培养后进行β-半乳糖苷酶活性测定，结果（如图乙）表明，应选择质粒 并在 的温度下用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏，理由是 。

(3)β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色。请利用(2)筛选得到的质粒（记为pR)为工具，用固体培养基初步比较外源启动子A和B的活性，试写出简要的实验思路 。
【答案】(1)SacⅡ、BglⅡ
(2) 氯霉素 P06 28℃ 28℃条件下，β-半乳糖苷酶活性最低，对外源性启动子活性检测干扰最小
(3)将PR空质粒、PR-A、PR-B分别导入LacZ基因缺失菌种中，并接种到含有X-gal平板上，在适宜条件下培养，检测不同组平板上菌落菌落蓝色深浅
【分析】1.工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
2.基因工程技术的基本步骤：1、提取目的基因；2、目的基因与运载体结合；3、将目的基因导入受体细胞；4、目的基因的检测和表达。
【详解】（1）切割质粒p-lacZ时，不能破坏复制原点和标记基因，所以不能选择限制酶EcRⅠ和BamHⅠ，依据基因转录方向，且MCS自身序列也可能会启动下游基因的表达，酶切位点应位于转录的上游，且应实行双酶切法，所以应选择限制酶SacⅡ、BglⅡ切割质粒p-lacZ，然后将MCS与p-lacZ连接构建成质粒p01。在此基础上对MCS列进行不同改造分别得到质粒p02、p03、p04、p05、p06。
（2）构建的重组质粒中含有氯霉素抗性基因，所以将质粒p01~p06分别与lacZ基因缺失菌株混合后接种至含氯霉素的液体培养基中培养并筛选出成功转入质粒的菌株，然后分别于28℃和37℃条件下培养后进行β-半乳糖苷酶活性测定。LacZ基因编码产物为β-半乳糖苷酶，若β-半乳糖苷酶活性较低，说明其对外源性启动子活性检测干扰较小，则用于插入外源启动子进行活性检测较为灵敏，反之较大，据图，质粒p06在28℃的温度条件下，β-半乳糖苷酶活性最低，对外源性启动子活性检测干扰最小，说明用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏。
（3）依据题干信息可知，实验的自变量为外源启动子的不同，实验应分为三组，分别将不含外源启动子的pR空质粒、pR-A、pR-B导入LacZ基因缺失菌种中，并接种到含有X-gal平板上，在适宜条件下培养，检测不同组平板上菌落菌落蓝色深浅，蓝色越深，说明其活性越强。
27．（2025·广东茂名·二模）研究表明，长期熬夜将导致肠道活性氧（ROS）积累，从而引起机体代谢紊乱甚至猝死。补充褪黑素可以清除ROS，但是过量褪黑素会进入血液，带来副作用。益生菌EcN可以在肠道内至少生存1周，而其自身无法产生褪黑素。某研究团队在EcN中构建了以血清素为底物合成褪黑素的代谢通路（如图1），提出利用工程菌EcN“定点”、“持续”、“可控”地递送褪黑素以维护熬夜人群肠道健康的新思路。基因工程的关键步骤如图2。请回答下列问题:


注:pMV、pBAD为质粒，Apr为AMP抗性基因，araC为调节蛋白，Para为阿拉伯糖启动子，His为标签蛋白。
(1)图2显示了基因工程的核心步骤： 。通过无缝克隆的方式，目的基因插入到载体pBAD中 的下游，且与His标签相连。
(2)由图2可知，与常规方法相比，无缝克隆法中载体的线性化和插入片段的扩增，均使用 法；唯一区别是在设计扩增插入片段的引物时，需保证插入片段末端与线性化载体末端有15-20bp的同源序列。连接时，利用3'端核酸外切酶水解PCR产物3'端的核苷酸，暴露载体和插入片段同源部分，同源序列即可通过 原则实现载体和插入片段的连接。由此归纳无缝克隆的优点有 。
(3)分子水平检测表明导入重组质粒的EcN已成功表达目的蛋白。若要从个体生物学水平鉴定导入pBAD-Psmf的EcN或导入pBAD-OsCOMT的EcN所产生的目的蛋白活性，请结合图1简要描述鉴定方法： 。
(4)本研究已在EcN中成功构建了以血清素为底物合成褪黑素的代谢通路。请结合题干信息提出进一步探究思路： 。
【答案】(1) 基因表达载体的构建 阿拉伯糖启动子/Para
(2) PCR 碱基互补配对 进行一个或者多个目的基因的插入/且不依赖限制酶和DNA连接酶
(3)以适量血清素为底物，检测导入pBAD-Psmf的EcN产生N-乙酰血清素的浓度在单位时间内的变化情况/以适量N-乙酰血清素为底物，检测导入pBAD-OsCOMT的EcN产生褪黑素的浓度在单位时间内的变化情况。
(4)探讨外源蛋白表达量（Psmf或OsCOMT）对EcN生存率的影响/探究如何改造当前的基因工程菌EcN，才能最终实现在肠道内“定点”、“持续”、“可控”地清除活性氧
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）基因工程的步骤包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因及其表达产物的检测，其中基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。结合图示可知，目的基因Psmf插入到载体pBAD中的下游，且与His标签相连。
（2）无缝克隆法中载体的线性化和插入片段均通过PCR技术进行扩增。由于插入片段末端与线性化载体末端有15-20bp的同源序列，因此可通过碱基互补配对原则实现载体和插入片段的连接。相比常规方法，无缝克隆的优点有进行一个或者多个目的基因的插入且不依赖限制酶和DNA连接酶。
（3）本项研究的目的是定点、持续、可控的获得褪黑素，因此从个体生物学水平鉴定导入pBAD-Psmf的EcN或导入pBAD-OsCOMT的EcN所产生的目的蛋白活性，检测的方法步骤是以适量血清素为底物，检测导入pBAD-Psmf的EcN产生N-乙酰血清素的浓度在单位时间内的变化情况/以适量N-乙酰血清素为底物，检测导入pBAD-OsCOMT的EcN产生褪黑素的浓度在单位时间内的变化情况。
（4）结合题干信息分析，补充褪黑素的目的是清除ROS，若可以通过其它方法清除活性氧则无需持续获得褪黑素，因此探究如何改造当前的基因工程菌EcN，才能最终实现在肠道内“定点”、“持续”、“可控”地清除活性氧。血清素合成褪黑素需要Psmf和OsCOMT，可研究外源蛋白表达量（Psmf或OsCOMT）对EcN生存率的影响。
三、解答题
28．（2025·广东揭阳·模拟预测）I型遗传性酪氨酸血症（HT1）是一种酪氨酸代谢异常引发肝损伤的疾病。研究人员基于益生大肠杆菌（EcN）设计了一种能高效代谢酪氨酸的肠道工程益生菌（EcN-HT）用于治疗HT1模型小鼠，如图1所示。其中，基因TyrP（编码酪氨酸转运蛋白TyrP）和基因HpaBC（编码酶HpaBC，催化酪氨酸代谢生成无毒物质L-D0PA）均为目的基因。图2表示质粒pUC57的结构示意图以及相关限制酶的识别序列和切割位点。请回答下列问题：
(1)图1中，TyrP需要表达在EcN-HT的细胞膜上，以促进对酪氨酸的吸收。则EcN-HT中参与TyrP的合成与定位的结构有 。
(2)图2中pfnr的基本组成单位是 。在 条件下，一些特定的信号分子会与pfnr结合，进而改变其构象或活性，使其能与RNA聚合酶更有效地结合，启动下游基因表达。
(3)为实现高效构建重组质粒并筛选获得EcN-HT工程菌，研究人员开展以下实验：
I．获得含基因TyrP的菌株EcN-T。
①获取基因TyrP；
②选用限制酶EcRI和Smal，分别切割含基因TyrP的DNA片段和质粒pUC57，构建重组质粒pUC57-T；
③将pUC57-T导入EcN，并将其接种在含有X-gal、卡那霉素的固体培养基甲上，培养一段时间后，菌落呈 色的为目的菌株EcN-T。
Ⅱ．获得含基因TyrP和HpaBC的EcN-HT工程菌。
④获取基因HpaBC；
⑤选用限制酶 ，构建重组质粒pUC57-H；
⑥将pUC57-H导入EcN-T，并将其接种在培养基乙上，以筛选出含双质粒的菌株EcN-HT。相比培养基甲，培养基乙特有的成分是 。
(4)图3显示目的基因TyrP两端的部分碱基序列，为获得能与质粒pUC57相连接的目的基因，PCR时设计的引物应选用________。
A．5'-AAGGCACCCGGG-3'和5'-TGTTACGAATTC-3'
B．5'-AAGGCACCCGGG-3'和5'-CATTGTGAATTC-3'
C．5'-GAATTCAAGGCA-3'和5'-CCCGGGCATTGT-3'
D．5'-GAATTCTGTTAC-3'和5'-CCCGGGAAGGCA-3'
(5)进一步研究表明，EcN-HT可以有效缓解HT1模型小鼠肝脏损伤等病症，其作用机理是 。
【答案】(1)核糖体，细胞膜
(2) 脱氧核苷酸 厌氧/低氧/缺氧
(3) 白 BglⅡ、EcRI 氯霉素
(4)C
(5)EcN-HT可以吸收酪氨酸，使其转变成无毒物质（减少小鼠体内酪氨酸及毒性中间代谢产物的蓄积）
【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）图1中，TyrP需要表达在EcN-HT的细胞膜上，说明TyrP的合成及加工过程与分泌蛋白的类似，即在核糖体中以氨基酸为原料合成肽链，经过内质网的加工、折叠以及高尔基体的进一步的修饰加工，然后通过囊泡转运到细胞膜上。可见，EcN-HT中参与TyrP的合成与定位的结构有核糖体和细胞膜。
（2）启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。图2中pfnr为厌氧启动子，其基本组成单位是脱氧核苷酸。在厌氧（或低氧或缺氧）条件下，一些特定的信号分子会与pfnr结合，进而改变其构象或活性，使其能与RNA聚合酶更有效地结合，启动下游基因表达。
（3）Ⅰ、基因lacZr表达的酶蛋白可将无色的X-gal水解成蓝色产物。由图2可知：基因lacZr在限制酶EcR I的识别序列和切割位点内。构建重组质粒pUC57-T时，用限制酶EcRI切割质粒pUC57，基因lacZr的结构被破坏，不能表达相应的酶蛋白，所以将pUC57-T导入EcN，并将其接种在含有X-gal、卡那霉素的固体培养基甲上。培养一段时间后，成功导入pUC57-T的菌落呈白色，此白色菌落即为目的菌株EcN-T。
Ⅱ、获得含基因TyrP和HpaBC的EcN-HT工程菌。构建重组质粒pUC57-T时，选用了限制酶用限制酶EcRI和SmaI，这两种酶破坏了标记基因Cmr（氯霉素抗性基因）和lacZ，lacZ表达的酶蛋白可将无色的X-gal水解成蓝色产物，该重组质粒中含有Kanr标记基因（卡那霉素抗性基因），因此筛选受体菌株EcN-T，应使用含有X-gal、卡那霉素的固体培养基甲。目的基因应该插入到启动子和终止子之间，可选的限制酶只有BglⅡ、EcRⅠ、MbⅠ、SmaⅠ，由于BglⅡ的识别序列中含有MbⅠ识别序列，如果使用MbⅠ，Bgl Ⅱ的识别序列也会被切割，且由于重组质粒pUC57-T破坏了标记基因Cmr（氯霉素抗性基因），为了区分两者不同，那么构建的重组质粒pUC57-H不能破坏该标记基因，因此构建重组质粒pUC57-H需选用限制酶BglⅡ、EcRⅠ。综上分析，筛选时，固体培养基乙应加入卡那霉素、氯霉素、X-gal。相比培养基甲，培养基乙特有的成分是氯霉素。
（4）由于构建重组质粒pUC57-T时，选用限制酶EcRI和SmaI分别切割含基因TyrP的DNA片段和质粒pUC57，根据该基因的转录方向和质粒中启动子和终止子的位置，该基因的左端应该加上EcRⅠ识别序列，右端应该加上SmaⅠ识别序列，由于DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸子链，因此左端的引物应该是5'-GAATTC AAGGCA-3'，同理，右端的引物是5'-CCCGGGCATTGT-3'，ABD错误，C正确。故选C。
（5）I型遗传性酪氨酸血症（HT1）是一种酪氨酸代谢异常引发肝损伤的疾病。在肠道工程益生菌（EcN-HT）体内，基因TyrP编码的酪氨酸转运蛋白TyrP有助于细胞吸收酪氨酸，基因HpaBC编码的酶HpaBC能催化酪氨酸代谢生成无毒物质L-DOPA。可见， EcN-HT可以有效缓解HT1模型小鼠肝脏损伤等病症，其作用机理是：EcN-HT可以吸收酪氨酸，使其转变成无毒物质（减少小鼠体内酪氨酸及毒性中间代谢产物的蓄积）。
29．（2025·广东广州·三模）我国科研人员培育出复粒水稻（CL），与普通单粒水稻（NCL）相比，具有多粒簇生的特点。
(1)油菜素内酯（BR）是一种植物激素，是参与调节水稻籽粒生长发育的有机物。研究人员利用图1质粒转录得到两种RNA探针，通过RNA杂交技术检测了CL和NCL幼穗不同部位中BRD3（BR降解酶）基因的转录情况，具体步骤如下表，结果如图2.请将实验材料补充完整（填选项）。
a.NcI b.SalI c.T7RNA聚合酶 d.SP6RNA聚合酶
2种水稻幼穗组织显色情况为 。
(2)蛋白GSK和MADS均为BR信号通路中的调控因子，在体外进行实验的处理和结果如图3，结果说明 。经过一系列的研究，科研人员阐明了水稻通过BR-GSK-MADS通路调控复粒性状。
(3)已有研究表明，BR缺陷水稻的籽粒通常会变小。请从基因选择性表达的角度解释“CL同时具有多粒簇生和籽粒不变小特点”的原因 。
【答案】(1) a b d c 对照组无显色反应，实验组CL的P中有较深的颜色，CL的S、NCL的P和S中颜色接近且较淡
(2)GSK可以促进MADS的磷酸化，去磷酸化酶会引起MADS的去磷酸化
(3)在CL的BRD3基因在花梗分生组织中表达量较高，BR含量低，通过BR-GSK-MADS通路促进复粒性状的形成；在小穗分生组织中BRD3基因表达量较低，BR含量高，保证籽粒不变小。
【分析】植物激素是由植物体产生的，能从产生部位运输到作用部位、对植物生命活动起到调节作用的微量有机物；启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，起到驱动转录的作用。
【详解】（1）①要得到与BRD3的mRNA互补的探针，根据图中基因转录方向以及启动子位置，需要用a限制酶NcⅠ切割质粒，使得转录能从与BRD3基因的cDNA转录方向相反的方向进行。②要得到与BRD3的mRNA相同的探针，需要用b限制酶SalⅠ切割质粒，使得转录能从与BRD3基因的cDNA转录方向相同的方向进行。③当用NcⅠ切割质粒后，启动转录需要d：SP6RNA聚合酶，因为此时是SP6启动子起作用。④当用SalⅠ切割质粒后，启动转录需要c：T7RNA聚合酶，因为此时是T7启动子起作用。由于实验组探针与BRD3的mRNA互补，对照组探针与BRD3的mRNA相同，预期结果应该是在NCL和CL幼穗组织中，实验组CL的P部位有显色反应（因为能与BRD3的mRNA杂交），其他无显色反应（NCL的P部位BRD3表达量低，对照组不能与BRD3的mRNA杂交 ，因为是相同序列，不会互补配对结合）。
（2）观察实验设置，有加入MADS、GSK、去磷酸化酶不同组合的情况，检测指标是磷酸化的MADS。当加入MADS时，均会出现磷酸化的MADS；而同时加入MADS和GSK组，磷酸化的MADS基本不变，说明GSK基本可以维持MADS的磷酸化；而加入MADS、GSK和去磷酸化酶时，磷酸化的MADS大量减少。这表明去磷酸化酶能使MADS去磷酸化。
（3）在CL中，与多粒簇生相关的基因在特定细胞中选择性表达，使CL表现多粒簇生；同时，与籽粒大小相关的细胞中BR - GSK - MADS通路相关基因正常表达，维持籽粒正常大小，所以CL同时具有多粒簇生和籽粒不变小特点。
30．（2025·广东广州·模拟预测）实体瘤是器官或组织中的有形肿块，可通过增强人体免疫系统功能治疗。大肠杆菌能进入实体瘤核心且活性强，科研人员欲利用它构建基因表达可控的工程菌，用于特定部位实体瘤的免疫治疗。科研人员构建了温控表达的质粒系统（如图），此系统类似“基因电路”，其中Tcl42基因像“开关”，42℃加热时能瞬时激活特定基因。质粒系统核心基因有酶 Bxb1 基因、用于免疫治疗的分泌型 aPD-L1蛋白基因等。人体特定部位经 42℃处理后，p7在酶Bxbl 作用下翻转，免疫元件中的 GFP和aPD-L1基因得以成功表达。回答下列问题：
注：1．基因TetR是抗四环素的抗性基因，GFP基因是绿色荧光蛋白基因；2．“◀”、“▷”是酶Bxbl的作用位点；3．“■”是终止子，可以有限终止其上游基因的转录。
(1)推测p7应为 （填“启动子”或“终止子”），其功能是 。
(2)Tc142为来自λ噬菌体的温度敏感型转录抑制因子，在大肠杆菌中具强活性的启动子pLac可以使Tc142持续性表达，当温度 （填“低于” “等于”或“高于”）42℃时，Tc142蛋白会抑制启动子pRL。
(3)请选择相关选项完善该“基因电路”的技术路线：用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，构建“基因电路”→①→酶Bxb1基因不表达→免疫元件无功能（不表达aPD-L1）→②→解除Tc142蛋白对启动子pRL的抑制→③→④→细菌合成GFP，并分泌大量aPD-L1。
题中的①②③④分别为 ； ； ； 。（将下列选项代号填入横线，将“基因电路”补充完整）
A．菌体升温至42℃时，蛋白Tcl42失去活性
B．受体菌37℃时
C．荧光蛋白GFP基因、aPD-L1基因的转录
D．酶Bxb1基因表达，进而引起p7两侧发生重组
(4)将“基因电路”质粒导入菌体前，科研人员用Ca2+处理大肠杆菌的作用是 。导入后的菌体最适合用 方法接种于含四环素的培养基上，由此成功构建用于免疫治疗的温控工程菌。
【答案】(1) 启动子 RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因的转录
(2)低于
(3) B A D C
(4) 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 稀释涂布平板
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法；（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）根据题意“p7可在重组酶Bxb1作用下翻转，免疫元件中的GFP和aPD-L1两种基因可以成功表达”，说明p7为启动子，启动子是RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因的转录。
（2） 已知在人体特定部位进行42℃处理后，p7可在重组酶Bxb1作用下翻转，免疫元件中的GFP和aPD-L1两种基因可以成功表达，因此当温度低于42℃时，Tcl42蛋白会抑制启动子pRL。
（3） “基因电路”的技术路线要起作用，第一步要构建“基因电路”，因此要先用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，使这些元件能够连接成“基因电路”；依题意，当温度不到42℃时具强活性的启动子pLac可以使Tcl42持续性表达，抑制启动子pRL，则与其构成一个表达单位的重组酶Bxb1基因不表达 。重组酶的作用位点在免疫元件中，重组酶Bxb1基因不表达，则αPD-L1不表达，免疫元件无功能；当控温至42℃时解除蛋白Tcl42对启动子pRL的抑制，重组酶Bxb1基因表达，进而引起启动子p7两侧发生重组，启动子p7启动荧光蛋白GFP基因、αPD-L1基因的转录。从而使细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。综合以上分析，“基因电路”的技术路线是：用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，构建“基因电路” → B、受体菌37℃时，蛋白Tcl42抑制启动子pRL →重组酶Bxb1基因不表达→ 免疫元件无功能（不表达αPD-L1） →A、菌体升温至42℃时，蛋白Tcl42失去活性→ 解除蛋白Tcl42对启动子pRL的抑制→D、重组酶Bxb1基因表达，进而引起启动子p7两侧发生重组→C、启动子p7启动荧光蛋白GFP基因、αPD-L1基因的转录→细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。
（4）科研人员用Ca2+处理大肠杆菌是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将“基因电路”质粒导入菌体内。依题意，重组的质粒中带有抗四环素的抗性基因，因此，可用稀释涂布平板法将导入后的菌体接种在含有四环素的培养基来筛选含重组质粒的受体细胞，能在该培养基上形成的菌落就是成功构建用于免疫治疗的温控工程菌菌落。
31．（2025·广东深圳·模拟预测）RCA是一种核基因（rca）编码的叶绿体蛋白。为研究RCA对光合作用的影响及机理，科研人员构建反义rca基因表达载体（rca基因反向插入表达载体），利用农杆菌转化法导入大豆细胞，成功获得rca基因沉默的转基因品种（如图1），①~⑥表示相关过程。
(1)参与过程①的酶有 （答两种即可），若反转录PCR产物中除了目的基因外有其他DNA片段存在，原因可能是 （答2条）。已知①过程rca基因的b链和获取它的模板mRNA互补，依据图1中给出的引物1设计区的碱基序列及限制酶的信息，从5'端到3'端写出引物1的碱基序列 （只写出前8个碱基即可）。
(2)过程②用C4pdk启动子替换Ti质粒上原有启动子的目的是 ，过程④常用的方法是 ，⑤过程后可用含 抗生素的培养基筛选出转化成功的大豆细胞。
(3)科研人员将野生型大豆和转基因大豆在适宜的光照条件下进行培养，一段时间后分别测定相关指标，结果如图2（Rubisc是光合作用暗反应中的一种关键酶）。据图分析，RCA对光合作用的影响及机理是 。
【答案】(1) 反（逆）转录酶、耐高温的DNA聚合酶 引物较短，特异性较低，同时扩增出目的基因和其他DNA片段；复性温度过低，出现非特异性扩增条带；杂DNA污染（写出2点即可） 5'-CTCGAGGT-3
(2) 驱动目的基因在光诱导下在叶肉细胞中特异性表达 钙离子（Ca2+）处理法 潮霉素
(3)通过提高Rubisc活力来促进光合作用
【分析】基因工程的操作步骤包括目的基因的筛选和获取、基因表达载体的构建、把目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。
【详解】（1）过程①为反转录PCR，因此需要的酶有反（逆）转录酶、热稳定DNA聚合酶等。在反转录PCR的过程中，引物较短，特异性较低，同时扩增出目的基因和其他DNA片段；复性温度过低，出现非特异性扩增条带；其它DNA污染，这些原因均会导致扩增产物出现非目的基因片段。 目的基因rca基因中已经存在BamH Ⅰ和Sal Ⅰ的酶切位点（质粒上也已有Sal Ⅰ的酶切位点”，所以在rca基因的上游不宜再选用Sal Ⅰ，这样会破坏目的基因，而应该选用与Sal Ⅰ产生相同黏性末端的Xh Ⅰ（同尾酶）。①过程rca基因的b链和获取它的模板mRNA互补，则b链是模板链，质粒上用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ切割，rca基因用BglⅡ（与BamH Ⅰ属于同尾酶）和Xh Ⅰ切割，由于目的基因是反向接入，所以目的基因左侧连接BglII识别序列，右侧连接XhⅠ识别序列。引物Ⅰ的碱基序列应该是5'-CTCGAGGT-3'。这样，质粒上用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ切割，rca基因用BglⅡ（与BamH Ⅰ属于同尾酶）和Xh Ⅰ切割。
（2）C4pdk启动子是受光诱导的强启动子，驱动目的基因在光诱导下载叶肉细胞中特异性表达，经过程②替换Ti质粒上原有启动子的目的是可使目的基因在大豆叶肉细胞中特异性表达。过程④是将重组质粒导入到农杆菌中，常用的方法Ca2+处理农杆菌。由图可知T-DNA内部含有潮霉素抗性基因，因此⑤过程后可用含潮霉素的培养基筛选出转染成功的大豆细胞。
（3）与野生型大豆相比，转基因大豆的rca基因沉默，无RCA蛋白，光合速率降低，则可知RCA对玉米的光合作用具有促进作用。由图可知，rca基因沉默时Rubisc活力下降，因此可推测RCA对大豆的光合作用的作用机理为RCA可提高Rubisc活力，促进暗反应，进而促进光合作用。
32．（2025·广东深圳·模拟预测）土壤盐渍化严重影响植物生长发育，研究植物应对盐胁迫的机制对提高作物产量至关重要。图1表示在不同盐浓度处理下，野生型拟南芥（WT）、CDK8缺失突变体（cdk8）和AHL10缺失突变体（ahl10）的净光合速率变化。请回答下列问题：

注：基因1编码的铁氧还蛋白主要参与NADPH的形成。基因2为盐胁迫响应基因，可减弱盐胁迫对基因1的影响，S蛋白能抑制基因2的表达。
(1)据图1可知，随着盐浓度的升高，WT的净光合速率变化趋势是 。CDK8对植物在盐胁迫下维持光合能力具有 （填“促进”或“抑制”）作用。
(2)为进一步探寻CDK8在盐胁迫下调控光合能力的机理，科研人员测定了盐胁迫下植物体内相关基因表达量和S蛋白招募量（图2）。盐胁迫下基因1的表达量 ，该变化影响光合作用的 阶段，进而影响植物的光合速率。研究发现，CDK8通过直接磷酸化AHL10来促进其降解，推测CDK8在盐胁迫响应中调控光合能力的分子机制： 。
(3)据上述研究提出一种提高作物耐盐性的育种策略： 。
【答案】(1) 先基本不变，后下降 促进
(2) 下降 光反应 CDK8通过直接磷酸化AHL10，促进其降解，从而减少S蛋白招募量，解除对盐胁迫相应基因（基因2）的抑制，使基因2表达量增加，减弱盐胁迫对基因1的抑制，维持光合能力
(3)通过基因工程技术提高作物中CDK8基因的表达量（或培育CDK8基因高表达的作物品种）或降低AHL10基因的表达量（或使AHL10基因发生突变或持续磷酸化）
【分析】分析图1，与WT相比，在不同盐浓度下，CDK8缺失突变体净光合速率明显降低。分析图2，与对照组相比，盐胁迫下WT组基因1和S蛋白招募量减少，基因2表达量增加，而与WT组相比，盐胁迫处理的CDK8组S蛋白招募量有所增加，基因2表达减少。
【详解】（1）据图1可知，随着盐浓度的升高，WT的净光合速率变化趋势是先基本不变，后下降。与WT相比，在不同盐浓度下，CDK8缺失突变体净光合速率明显降低，说明CDK8对植物在盐胁迫下维持光合能力具有促进作用。
（2）由图2可知，与对照组相比，盐胁迫下的WT组基因1的表达量下降，基因1编码的铁氧还蛋白主要参与NADPH的形成，故该变化影响光合作用的光反应阶段，进而影响植物的光合速率。分析图2，盐胁迫下，基因1和S蛋白招募量减少，基因2表达量增加，而与WT组相比，盐胁迫处理的CDK8组S蛋白招募量有所增加，基因2表达减少，又CDK8通过直接磷酸化AHL10来促进其降解，故推测CDK8在盐胁迫响应中调控光合能力的分子机制为CDK8通过直接磷酸化AHL10，促进其降解，从而减少S蛋白招募量，解除对盐胁迫相应基因（基因2）的抑制，使基因2表达量增加，减弱盐胁迫对基因1的抑制，维持光合能力。
（3）结合上题可知，要提高作物耐盐性，可通过基因工程技术提高作物中CDK8基因的表达量（或培育CDK8基因高表达的作物品种）或降低AHL10基因的表达量（或使AHL10基因发生突变或持续磷酸化）。
33．（2025·广东珠海·模拟预测）亚洲玉米螟是造成我国玉米减产的主要害虫。我国科研人员通过图示过程将Bt基因（能够控制合成Bt毒蛋白）转入玉米细胞培育出了抗虫转基因玉米。回答下列问题：
(1)用PCR扩增下面的Bt基因的DNA片段5'-GACCTGTGGAAGC．'供选择的引物有：①5'-CTGGACACCT-3'②5'-GACCTGTGGA-3'③5'-GTTAGGGCAT-3'④5'-CAATCCCGTA-3'共四种，应选择 （填字母）。
A．①②B．②③C．②④D．③④
(2)据图分析，为确保目的基因能够与Ti质粒正确连接，形成含有目的基因的重组Ti质粒，科研人员应选用限制酶 切割Ti质粒和含Bt基因的DNA片段。在获得重组Ti质粒后，可将其加入经 处理的农杆菌；导入重组质粒的玉米细胞经 技术成为转基因玉米植株。
(3)为检测转基因玉米是否培育成功，科研人员利用 法检测Bt基因是否成功翻译；在进行个体生物学水平的鉴定时，科研人员将获得的多株转基因玉米进行自交，发现除少数植株的子代均抗虫外，多数植株的子代中均出现了不抗虫植株。统计某植株的子代中抗虫与不抗虫的比例为15:1，出现该比例的原因是 。
(4)某科研小组在做抗虫棉试验时，虽已经检测出棉花植株中含有抗虫基因，但让棉铃虫食用棉花叶片时，棉铃虫并没有被杀死，可能的原因是① ；② 。
【答案】(1)C
(2) XbaⅠ和HindⅢ Ca2+ 植物组织培养
(3) 抗原-抗体杂交 在两对同源染色体的各一条染色体上转入了抗虫基因
(4) Bt毒蛋白基因没有成功转录 Bt毒蛋白基因没有成功翻译
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。目的基因的检测与鉴定包括分子水平上的检测与个体水平上的鉴定两种方式。
【详解】（1） PCR引物应分别与待扩增片段两端的互补链3′端结合，且引物序列与其结合处应保持“正向一致”。Bt基因的DNA片段的上链(5′→3′)是GACCTGTGGAAGC…CATACGGGATTG，对应的下链(3′→5′)是CTGGACACCTTCG…GTATGCCCTAAC。前向引物通常与上链5′端相同序列（②），后向引物则与上链3′端互补且方向为5′→3′（④），应选②和④。故选C。
（2）据图分析，在构建目的基因表达载体外，由于BamHⅠ能将目的基因切割，因此不能用BamHⅠ切割，因此对于目的基因的左侧只能用XbaⅠ切割，而右侧HindⅢ和EcRⅠ是目的基因和终止子近侧共有的限制酶，但目的基因的左侧有EcRⅠ的识别序列，因此目的基因右侧需要用HindⅢ切割，因此，为确保目的基因能够与Ti质粒正确连接，形成含有目的基因的重组Ti质粒，科研人员应选用限制酶XbaⅠ和HindⅢ切割Ti质粒和含Bt基因的DNA片段；在获得重组Ti质粒后，可将其加入经Ca2+处理（使其处于易于吸收周围环境DNA分子的状态）的农杆菌；导入重组质粒的玉米细胞经植物组织培养成为转基因玉米植株，该操作的原理是植物细胞的全能性。
（3）翻译的产物是蛋白质，由于抗原与抗体的结合具有特异性，故为检测转基因玉米是否培育成功，可在分子水平条件下，科研人员首先利用抗原—抗体杂交法检测Bt基因是否成功翻译；在进行个体生物学水平的鉴定时，科研人员将获得的多株转基因玉米进行自交，发现除少数植株的子代均抗虫外，多数植株的子代中均出现了不抗虫植株，统计某植株的子代中抗虫与不抗虫的比例为15:1，15∶1为9∶3∶3∶1的变式，说明目的基因转入了两条具有非同源染色体的两条染色体上，即在两对同源染色体的各一条染色体上转入了抗虫基因，进而通过自交产生了性状分离比为15∶1的后代表现。
（4）科学家最初做抗虫棉试验时，虽已经检测出棉花植株中含有抗虫基因，但让棉铃虫食用棉花叶片时，棉铃虫并没有被杀死，这说明Bt毒蛋白基因没有成功转录和翻译。
34．（2025·广东·二模）抗原检测技术在病毒感染筛查、病毒类型判断等多个方面均有应用，但传统检测技术成本较高。为降低成本，需开发新型抗原检测技术。我国科研人员以人畜共患的口蹄疫病毒FMDV为材料，将抗FMDV纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞（cRBC）纳米抗体NbRBC48的基因片段连接，构建双特异纳米抗体Nb205-48，利用Nb205-48建立可用于FMDV抗原检测的血凝方法。
(1)科研人员采用重叠延伸PCR技术构建Nb205和NbRBC48融合基因，具体路线如图。本实验中linker为含6个氨基酸序列的连接肽，部分PCR引物见下表。
①两个不同的基因得以融合的结构基础是 。
②重叠延伸PCR技术是先分别PCR获得目的链1和目的链2，然后使用引物 进行PCR获得融合基因。引物P2中决定linker的碱基序列是5′- -3′。
③在构建基因表达载体时，需用限制酶 对质粒和Nb205-linker-NbRBC48融合基因进行酶切。
(2)科研人员将重组质粒导入大肠杆菌表达并纯化获得双特异纳米抗体Nb205-48，并对融合双抗的敏感性进行了检测，结果见图。结果表明 ，说明融合双抗构建成功。
(3)在对融合双抗Nb205-48进行推广前，还需进行的研究有 。
【答案】(1) DNA分子具有双螺旋结构 P1和P4 5′-GACCCCAGCTCCAAAGCT-3′ NdeⅠ、NtⅠ
(2)Nb205-48可同时与FMDV及cRBC反应，且反应性能与Nb205和NbRBC48无明显差异
(3)与传统检测方法进行灵敏度/准确性/效率比较（检测方法的稳定性；与其他病毒有无交叉反应等）
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）①基因是有遗传效应的DNA片段，两个不同的基因得以融合的结构基础是具有相似的DNA结构，即DNA分子具有双螺旋结构。
②结合图示可知，先分别用(P1、P2)与(P3、P4)扩增得到目的链1和目的链2，再仅使用P1、P4进行第二轮PCR即能获得融合基因；引物需要与模板的3'端结合，据图可知，引物P2中决定linker的碱基序列是5′-GACCCCAGCTCCAAAGCT-3′，这段序列编码了连接肽的氨基酸序列，确保两个基因片段能够正确连接。
③在构建基因表达载体时，需要使用限制酶对质粒和融合基因进行酶切，以便将融合基因插入到质粒中。根据引物P1和P4的序列，P1中含有NdeⅠ限制酶切位点（CATATG），P4中含有NtⅠ限制酶切位点（GCGGCCGC）。因此，需要使用NdeⅠ和NtⅠ这两种限制酶对质粒和融合基因进行酶切，确保融合基因能够正确插入到质粒中。
（2）分析题图，与缓冲液相比，Nb205-48组别的FMDV和cRBC含量均显著升高，说明Nb205-48可同时与FMDV及cRBC反应，且反应性能与Nb205和NbRBC48无明显差异这一结果验证了双特异纳米抗体的功能，表明其能够用于FMDV抗原的检测。
（3）在对融合双抗Nb205-48进行推广前，还需进行的研究有灵敏度/准确性（进一步验证融合双抗是否只与FMDV抗原结合，而不与其他病毒或物质发生交叉反应）/效率比较（检测方法的稳定性；与其他病毒有无交叉反应等）。
35．（2025·广东茂名·二模）我国科研团队在育种中发现甜瓜果皮表现出丰富的颜色变化，除纯墨绿UDG、纯白WR外，还存在墨绿色斑纹SS（墨绿色部位SSG，白色部位SSW）。为研究其产生机制，设计并开展了相关实验，部分实验结果见图。
实验二
请回答下列问题：
(1)实验一，科研人员使用试剂 提取色素，实验结果表明甜瓜SS和UDG果皮的墨绿色部分产生的原因可能是 。
(2)为进一步探究甜瓜果皮颜色形成的遗传机理，设计并开展了实验二和三。
①实验二利用纯合亲本进行了多种杂交实验，实验二结果表明墨绿色可能由 基因控制，F1和F2中纯墨绿色（UDG）甜瓜产生的原因可能是 （填“基因突变”或“基因重组”）。
②基因序列比对结果发现，果皮颜色由位于4号染色体上叶绿素合成基因CmAPRR2控制，与白色果皮（WR）甜瓜相比，甜瓜SS的CmAPRR2基因含有Tcml插入序列（如下图）。设计引物对一株甜瓜SS植株上生长的墨绿色斑纹（SS）和纯墨绿（UDG）甜瓜进行了PCR扩增（实验三），结果表明纯墨绿（UDG）甜瓜产生的原因可能是 。
注：F、R1和R2是引物。
(3)进一步研究发现，甜瓜SS的CmAPRR2基因中的Tcml序列能被随机剪切，产生不同长度的CmAPRR2基因。结合实验四结果（果实成熟期10天、25天、35天），推测实验二中F1SS自交后代出现少量墨绿色（UDG）的原因可能是 。
【答案】(1) 无水乙醇 叶绿素的积累
(2) 显性 基因突变 （UDG）甜瓜的基因CmAPRR2不存在Tcml序列，结构未被破坏，能合成并积累叶绿素，形成墨绿色瓜皮。
(3)在果实成熟过程中，Tcml序列全部被剪切，激活了CmAPRR2基因的表达，促进叶绿素的合成进而形成了全部墨绿色瓜皮。
【分析】1、绿叶中的色素能够溶解在有机溶剂无水乙醇中，所以，可以用无水乙醇提取绿叶中的色素。
2、基因分离定律的实质：在杂合子的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性;生物体在进行减数分裂形成配子时，等位基因会随着同源染色体的分开而分离，分别进入到两个配子中，独立地随配子遗传给后代。
3、PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术
【详解】（1）叶绿体中色素溶解于有机溶剂中，可用有机溶剂进行提取，通常用无水乙醇作为提取剂。由实验一结果可知，SSG和UDG含叶绿素含量明显更多，故叶绿素的积累导致甜瓜SS和UDG果皮呈墨绿色。
（2）①分析实验二表格数据，第①组实验亲本是具有相对性状的杂合子，子代为SS（UDG只有1个个体，可能是变异个体），F1为SS，表现墨绿色斑纹，可知墨绿色可能由显性基因控制。假设控制墨绿色的基因为A，控制白色的基因为a。亲本为具有相对性状的纯合子（AA、aa），若F1（Aa）、F2（AA、Aa、aa）要出现第三种表型纯墨绿色，只可能是通过基因突变产生了一个新的等位基因。
②据实验三电泳结果可知，UDG中的基因没有引物F/R2的扩增产物，则UDG中不含Tcml序列，故纯墨绿（UDG）甜瓜产生的原因可能是（UDG）甜瓜的基因CmAPRR2不存在Tcml序列，结构未被破坏，能合成并积累叶绿素，形成墨绿色瓜皮。
（3）SS的CmAPRR2基因中含Tcml序列，UDG甜瓜的基因CmAPRR2不存在Tcml序列。依题意，甜瓜SS的CmAPRR2基因中的Tcml序列能被随机剪切，产生不同长度的CmAPRR2基因。若F1传递给F2的含Tcml序列的CmAPRR2基因的Tcml序列全部被切除，则F1SS自交后代会出现UDG，但由于酶切的随机性，这种概率极低，故只能产生少量的墨绿色（UDG）。结合实验四的结果，故推测实验二中F1SS自交后代出现少量墨绿色（UDG）的原因可能是在果实成熟过程中，Tcml序列全部被剪切，激活了CmAPRR2基因的表达，促进叶绿素的合成进而形成了全部墨绿色瓜皮。
考点
5年考情（2021-2025）
命题趋势
考点1 发酵工程
2023·广东-10
2022·广东-选考21
2021·广东-选考21
从近五年广东省高考试题来看，发酵工程主要考察微生物的接种方法、培养基的配置和微生物的筛选等。细胞工程主要考察植物体细胞杂交技术、植物组织的培养及基本过程、动物细胞培养技术等。基因工程相关知识是高考的必考内容，也是高考难点，基因表达载体的构建、PCR扩增的原理与过程这些考点常在非选择题中出现。
考点2 基因工程
2025·广东-7
2025·广东-21
2024·广东-4
2022·广东-12
2024·广东-21
2023·广东-20
2022·广东-选考22
2021·广东-选考22
考点3 细胞工程
2025·广东-5
2023·广东-5
考点4 胚胎工程
2023·广东3
技术
组织培养
基因工程
发酵工程
体细胞杂交
A
①
②
③
④
B
②
①
④
③
C
①
③
④
②
D
④
②
③
①
生产工艺
川芎嗪含量/（mg·L-1）
发酵后熏醅前
发酵后进行传统熏醅
（80—90℃4—5d）
发酵后进行机械熏醅
（110—120℃12—24h）
传统醋酸发酵
0.38
3.15
11.18
机械醋酸发酵
1.33
4.73
17.63
选项
自然发生的生物学过程
受启示而发展的生物工程技术
A
肺炎链球菌的转化
基因工程
B
细胞中DNA的复制
PCR技术
C
同卵双胞胎的形成过程
胚胎分割
D
亲缘关系近的植物可杂交
植物体细胞杂交技术
各项指标
总氮//（mg·L-1）
总磷//（mg·L-1）
氟化物/（mg·L-1）
初始
23.2
4.32
4.56
培养转基因四尾栅藻11天后
1.9
0.45
0.84
组别
载体
胚
愈伤组织
存活率（%）
带芽的愈伤组织
转化效率（%）
1
对照载体
121
56
46.28
8
6.61
2
WUS+BBM
98
55
56.12
21
21.43
3
GRF-GIF
96
46
47.92
25
26.04
对照组1
对照组2
对照组3
实验组
野生型噬菌体
-
+
+
-
重组噬菌体
+
-
-
+
过量游离的EcRI蛋白
+
-
+
-
的抗体
+
+
+
+
感染能力
强

强
弱
步骤
实验组（探针序列与BRD3的mRNA互补）
对照组（探针序列与BRD3的mRNA相同）
使用限制酶将图1质粒切成线形
①
②
使用RNA聚合酶转录得到RNA，制备带标记的探针
③
④
取NCL和CL幼穗的组织，制作成临时装片
将探针加入处理好的装片中，结合探针的部位会产生显色反应
引物名称
引物序列（5′→3′）
P1
CATATGGATGATGATGATGATGAG（有下划线的为NdeⅠ限制酶切位点）
P2
GACCCCAGCTCCAAAGCTCCCAAAGCTCCCAACGGTCACTTGGGT
P3
AGCTTTGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGGAGTCTGGGGGAGGC
P4
GCGGCCGCTGAGGAGACGGT（有下划线的为NtⅠ限制酶切位点）
杂交类型
SS
UDG
WR
SS：WR
①PSS♀×WR♂
159
1
–
–
②PSS♂×WR♀
102
18
–
–
③F1–SS×F1–SS
537
34
183
3：1
④F1–SS×P–SS
94
2
–
–
⑤F1–SS×P–WR
82
–
108
1：1