第十单元　第61课时　基因工程的基本工具和基本操作程序-2025年高考生物大一轮复习（课件+讲义+练习）

这是一份第十单元　第61课时　基因工程的基本工具和基本操作程序-2025年高考生物大一轮复习（课件+讲义+练习），文件包含25版第十单元第61课时基因工程的基本工具和基本操作程序bbgrjjjqpptx、第十单元第61课时基因工程的基本工具和基本操作程序-2025年高考生物大一轮复习课件+讲义+练习教师版docx、第十单元第61课时基因工程的基本工具和基本操作程序-2025年高考生物大一轮复习课件+讲义+练习学生版docx、第十单元课时练61基因工程的基本工具和基本操作程序-2025年高考生物大一轮复习课件+讲义+练习专练docx、PCR反应原理swf等5份课件配套教学资源，其中PPT共60页， 欢迎下载使用。

1、注重基础;首先要通读教材。通过对教材的温习，能将课本相关知识有序地组织起来，形成知识链条和网络，使知识系统化、网络化，将所学的知识浓缩其中，将书本由“厚”变“薄”，了解各知识点在知识体系中的具体位置，弄清楚各知识点之间的内在联系，有利于联想记忆，也有利于深层次拓展知识，更利于培养综合运用知识去分析解决实际问题的能力。2、重视实验;从高考卷看，实验占有十分突出的位置。实验题不仅占分比例大，而且经常出现新的题型。是高考的重点也是难点，更是学生的失分点。 3、注重理论联系实际;生物的考试并不仅仅是考概念，学会知识的迁移非常重要，并要灵活运用课本上的知识。不过特别强调了从图表、图形提取信息的能力。历年高考试题，图表题都占有比较大的比例。 4、重视几种能力的训练。注重能力的考查是近几年高考的重点，基础知识是综合运用、提升能力的基石。夯实基础不能离开课本，无论什么综合题、联系实际的问题，原理都在课本里。在复习备考中，不能忽略现有教材的例子、资料分析、问题探讨、技能训练等。另外，生物考卷的阅读量越来越大，做题速度越来越重要，考生要在提高读题速度的同时不影响做题的正确率。
基因工程的基本工具和基本操作程序
2025年高考生物大一轮复习
1.概述基因工程是在微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展起来的。2.阐明重组DNA技术的三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序。
考点一　　基因工程的基本工具
考点二　　基因工程的基本操作程序
2.基因工程的诞生和发展(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明了DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间 。(2)DNA双螺旋结构的提出和 的证明。(3)中心法则的确立。(4) 的破译。(5)基因转移载体的发现。 的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
限制酶、DNA连接酶和逆转录酶
(6) 体外重组的实现。(7)重组DNA表达实验的成功。(8)DNA测序和合成技术的发明。(9) 技术的发明。(10) 技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
3.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)
提醒　①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。③在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
(1)基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的(　　)
(2)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA(　　)
(3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(　　)
(4)质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因(　　)
将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcRⅠ和NheⅠ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题：
(1)请用图示法写出限制酶EcRⅠ和NheⅠ切割后形成黏性末端的过程。
提示　限制酶EcRⅠ：
(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。
提示　用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其
中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。
(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的
两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶。
(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。
考向一　辨析基因工程的基本工具1.(2021·湖北，7)限制性内切核酸酶EcRⅠ识别并切割 双链DNA，用EcRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为A.6 B.250 C.4 000 D.24 000
2.(2024·连云港高三调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是
A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是bC.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶
与DNA有关的几种酶的比较
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞 或获得预期 等的基因。(2)筛选合适的目的基因①从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用 和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取①人工合成目的基因。②PCR 和扩增目的基因a.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种 与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行 的技术。b.PCR反应的条件：一定的 、DNA模板、2种 、4种____________、 DNA聚合酶，以及能自动调控 的仪器。
d.PCR产物的鉴定：常采用 来鉴定。
PCR技术和DNA复制的比较
③通过构建 来获取目的基因。2.基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因 ，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代
(2)基因表达载体的组成及作用
提醒　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
3.将目的基因导入受体细胞
辨析　(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
4.目的基因的检测与鉴定
(1)目的基因一定是编码蛋白质的基因(　　)
(2)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋(　　)
(3)基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束(　　)
(4)Ti质粒上的T－DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起(　　)(5)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(　　)
(6)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术(　　)
1.Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。回答下列问题：(1)什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？
提示　引物是指一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此复制DNA时应加入两种引物。
(2)PCR扩增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列吗？
提示　不需要，只要知道Bt基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。
(3)为检测Bt基因在转基因抗虫棉细胞中是否转录，科研人员提取棉花细胞中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Bt基因的cDNA，原因是什么？
提示　引物是依据Bt毒蛋白基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Bt基因的cDNA特异性结合)。
(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律如图所示，若一个Bt毒蛋白基因在PCR中经过n轮循环，理论上得到多少个DNA分子？含引物的DNA分子多少个？含其中一种引物的DNA分子多少个？同时含两种引物的DNA分子多少个？共需要消耗多少个引物？含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？含等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？
提示　经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2n个，含其中一种引物的DNA分子数(2n－1)个，同时含两种引物的DNA分子(2n－2)个，共需要消耗(2n＋1－2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子 (2n－2n)个。
(5)PCR扩增Bt基因的过程中需要解旋酶吗？并说明理由。所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？
提示　不需要解旋酶，因为PCR过程中，DNA双链在高温下即可完成解旋。由于PCR过程温度较高，故所需要的DNA聚合酶应具有耐高温的特点。
2.据图分析抗虫棉的培育过程。(1)该过程中的目的基因是________，载体是________。(2)基因工程中，往往使用两种限制酶切割目的基因，这样做的原因是什么？
提示　为了避免目的基因和载体的自身环化和反向连接。
(3)为了保证目的基因在受体细胞中能正确表达，对目的基因在质粒中的插入位点有什么要求？
提示　目的基因应插入启动子与终止子之间。
(4)该实例中，导入目的基因的方法是 。为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？
提示　由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入T－DNA，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。
(5)将目的基因导入受体细胞时，能否仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上？为什么？
提示　一般不能。如果仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，由于细胞分裂可能导致目的基因丢失，无法稳定遗传。
(6)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪些？
提示　抗原—抗体杂交、用棉叶饲喂棉铃虫。
考向二　辨析基因工程的基本操作程序3.(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一 定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒 构建成功与否D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
4.(2024·江苏扬州中学高三模拟)土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T－DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是A.目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNAB.用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞C.Ti质粒是一种环状DNA分子，没有双螺旋结构D.可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上
1. (选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的 ，创造出更符合人们需要的新的______________________。2.(选择性必修3 P71)限制酶能够识别 ，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。3.(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于 。
双链DNA分子的特定核苷酸序列
4.(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供 、 、4种 和耐高温的 。5.(选择性必修3 P77)真核细胞和细菌的 都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段________________________________________________，引物的作用是_________________________________________________。
链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
6.(选择性必修3 P80)基因表达载体的构建的目的：使目的基因_______________________________________，同时，使目的基因能够__________________。基因表达载体是载体的一种，除目的基因、___________外，还必须含有启动子、终止子等。启动子是______________识别和结合的部位，有了它才能驱动基因____________，最终表达出人类需要的_______。7.(选择性必修3 P81)转化：________________________________________________________________。
中稳定存在，并且遗传给下一代
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
8.(选择性必修3 P81～82)将目的基因导入植物细胞的方法是_____________、______________；导入动物细胞的方法是____________；导入微生物细胞的方法是_______处理法。
9.(选择性必修3 P82)目的基因的检测与鉴定：首先是分子水平的检测，包括通过_____等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA；从转基因棉花中提取_______，用相应的____进行_______________，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过__________________________来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫
10.如图为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点为：Hind Ⅲ(A↓AGCTT)、Pvit Ⅱ(CAG↓CTG)、KpnⅠ(G↓GTACC)、EcRⅠ(G↓AATTC)、PstⅠ(CTGCA↓G)、BamHⅠ(G↓GATCC)。为使phb2基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入 和 两种不同限制酶的识别序列。将经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用_______________(填“E.cli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
一、选择题1.(2024·泉州高三质检)像BclⅠ(－T↓GATCA－)、Bgl Ⅱ(－A↓GATCT－)、MbⅠ(－↓GATC－)这样，识别序列不同，但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是
2.(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.cli DNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.cli DNA连接酶连接
3.(2023·重庆，12)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是A.其中一个引物序列为 5′－TGCGCAGT－3′B.步骤①所用的酶是SpeⅠ 和CfⅠC.用步骤①的酶对载体进 行酶切，至少获得了2个片段D.酶切片段和载体连接时，可使用E.cli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
4.(2024·镇江高三二模)转基因植物中标记基因的剔除可有效防止基因污染，剔除常用分离剔除法和重组剔除法。分离剔除法是在转基因时将目的基因和标记基因分别构建在两个Ti质粒上，通过共转化得到转基因植物后让其自交得到不含标记基因的转基因个体；重组剔除法利用Cre/LxP重组酶系统，Cre酶能有效剔除重组载体中含有标记基因的序列，只留下一个LxP位点，具体原理如图。下列说法不正确的是
A.利用分离剔除法时，目的基 因和标记基因都应插到Ti质 粒的T－DNA序列内部B.分离剔除时目的基因和标记 基因插到植物细胞的同源染色体或非同源染色体上均可成功C.上述重组载体中启动子1在农杆菌中可发挥作用，而在植物细胞中不能 发挥作用D.经重组剔除后的标记基因，因没有启动子而无法启动基因的转录
5.如图是培育抗除草剂玉米的技术路线图，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列相关叙述正确的是
A.过程①中除草剂抗性基因插 入T－DNA中，导致T－DNA 片段失活B.过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化C.过程②用Ca2＋处理，使农杆菌细胞壁通透性改变，使其处于能吸收周围环 境中DNA分子的生理状态D.过程③应在培养基中加入除草剂和物质K
6.(2024·西安高三一模)我国科学家利用XbaⅠ和SacⅠ两种限制酶，并运用农杆菌转化法，将富含赖氨酸的蛋白质编码基因(含678 bp)导入某植物细胞，再经植物组织培养获得转基因植株，使赖氨酸的含量比对照组明显提高，如图表示相关培育过程(质粒的其他部位和目的基因内部均无XbaⅠ、SacⅠ、Hind Ⅲ的识别位点)，下列说法不正确的是
A.一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增4次，共产生8个等长DNA分子B.农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法C.植物组织培养过程中，培养基需添加卡那霉素以便筛选转基因植株D.使用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重组质粒后能得到1 500 bp左右的片段
7.自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。
下列相关叙述错误的是A.上述获得蓝色玫瑰的方案中不需 要转入能调控液泡pH的基因B.将sfp基因插入Ti质粒时使用的限 制酶是PmeⅠ和BamHⅠC.同时使用SpeⅠ和SacⅠ能提高idgS基因和Ti质粒的重组效率D.sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的
8.(2024·莆田高三质检)如图表示利用基因工程生产黄金大米时所构建的基因表达载体，其中基因Ⅰ和基因Ⅱ是β－胡萝卜素合成所必需的基因，基因Ⅲ表达的蛋白质可使细菌在特殊培养基上生长。下列分析错误的是A.A序列是该基因表达载体的复 制原点B.基因Ⅲ的作用是便于筛选该重 组质粒C.β－胡萝卜素是检测基因Ⅰ、基因Ⅱ表达的关键指标之一D.图中基因插入质粒时需要限制酶和DNA连接酶
9.(2024·南京高三联考)某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，使青蒿素合成过程中的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，其过程如图所示。下列有关叙述错误的是A.也可用PCR技术直接扩增RNA来获取目的基因B.酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键C.本过程中，可以采用一种、两种甚至四种酶2D.通过抗原—抗体杂交技术可检测fps基因是否表达出蛋白质
10.(2024·徐州高三质检)图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是A.若通过PCR技术提取该目 的基因，应该选用引物a 和引物cB.构建表达载体时可选用 BclⅠ和Hind Ⅲ这两种限制酶C.若将基因表达载体导入大肠杆菌中，需用Ca2＋处理大肠杆菌D.只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受体细胞
二、非选择题11.(2021·全国乙，38)用重组DNA技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，上图中________________酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接，上图中_________________________________切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
PstⅠ、SmaⅠ和EcR Ⅴ
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
(3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中 ；质粒DNA分子上有 ______________________ ，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是___________________________________________________________________________。
一至多个限制酶切割位点
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即
为含有质粒载体的宿主细胞
(4)表达载体含有启动子，启动子是指__________________________________________________________________________________________。
位于基因上游的一段有特殊序列结
构的DNA片段，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
12.(2021·福建，21)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为 。
①选用 酶将载体P切开，再用 __ (填“T4 DNA”或“E.cli81 DNA”)连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
②载体P′不具有表达MT基因的______和 。选用 ______ 酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用______离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是_________________________________________________________。
平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定
13.科研人员通过转基因技术培育出超量表达P蛋白的转基因甜玉米。在超量表达P基因载体的构建中，含P基因的DNA片段以及Ti质粒的酶切位点如图所示，其中强启动子能驱动基因的持续转录。请回答下列问题：
(1)以RNA为模板，通过RT—PCR技术可获取P基因。进行RT—PCR时，一般要加入4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而不是脱氧核苷酸，其原因是___________________________________________________________________________，同时需加入的酶有_______________________________。为了特异性扩增P基因序列，需根据 ________ 设计特异性引物。
dNTP 能为子链延伸过程提供能量和原料(或脱氧核苷酸只能作为原料而不能提供能量)
(2)在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是 和 ，这样操作不仅使P基因在玉米植株中超量表达，还可利用T－DNA的 _____ 特性，最终使P基因_______ __________ 。
玉米细胞染色体DNA上
(3)将农杆菌液浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养时，培养基中需加入 ，筛选出的愈伤组织经再分化过程形成丛芽，最终获得转基因玉米植株。
(4)对转基因再生玉米植株进行鉴定时发现，有些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有____________________________________________________________________________________________________________。
基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表达