备战高考生物一轮复习优质课件 第33讲 微生物的培养技术及应用

这是一份备战高考生物一轮复习优质课件 第33讲 微生物的培养技术及应用，共60页。PPT课件主要包含了微生物的基本培养技术，微生物，无细胞结构，原核细胞，真核细胞，微生物的类群，营养和环境，其他微生物无法混入，培养基，无菌技术等内容，欢迎下载使用。

微生物的选择培养和计数
微生物的基本培养技术
个体无法用肉眼观察的微小生物。
真菌：酵母菌、毛霉等；原生生物：草履虫、变形虫等
病毒：SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；噬菌体等DNA病毒
细菌:蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；放线菌:链霉菌等
①要为人们需要的微生物提供合适的___________条件。
②要确保 ，并将需要的微生物分离出来。
微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。
实验室培养微生物的条件
人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其_________的营养基质。
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或 。
碳源、氮源、水、无机盐
含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源
Ca、K 、Mg为大量元素Zn、Cu、Mn、C、M等微量元素
牛肉膏、蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质
满足微生物对 、 、 的需求。
④培养厌氧微生物时，需要提供 的条件。
①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加 ；
②培养霉菌时，需要将培养基调至 ；
③培养细菌时，需要将培养基调至 ；
维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等
主要提供碳源的是牛肉膏，主要提供氮源的是蛋白胨。
①加入培养基中的凝固剂（如琼脂），一般不能被微生物利用， 只起到凝固作用。
②微生物在固体培养基 表面生长，可以形成 肉眼可见的菌落。
观察微生物的运动、分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
（1）防止培养物被污染；
（2）防止感染实验操作者。
（1）消毒：是指使用较为 的物理、化学或生物等方法 杀死物体表面或内部一部分微生物。
（2）灭菌：是指使用强烈的理化方法杀死 的 微生物，包括芽孢和孢子。
3.防止杂菌污染的方法
避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触；为了避免周围环境微生物污染，操作应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。
使用较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部一部分微生物。
用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台。
100℃煮沸5-6min。
62-65℃下煮30min 或 80-90℃下煮30s-1min。
用70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源。
湿热灭菌法、干热灭菌法、灼烧灭菌法
高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121℃下维持15-30min
①原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性。②优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭 所有的生物，包括最耐热的某些 微生物的休眠体。基本保持培养基 的营养成分不被破坏。③对象：培养基等。
注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。
干热灭菌箱内160~170 ℃下加热2~3h。
①原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等。②对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于玻璃器皿 (如试管、培养皿、吸管、注射器) 金属器具 (如针头、 镊子、剪刀等)的灭菌。
常用于涂布器、接种环、接种针、试管口或其它金属用具等的灭菌。直接在酒精灯火焰的充分燃烧层（外焰）灼烧。
①效果：最彻底②原理：使微生物燃烧③对象：接种工具如接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位。
较为温和理化方法，杀死部分微生（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
100 ℃煮沸5～6 min
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线照射30 min
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
培养基、培养皿等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
接种室、接种箱，超净工作台
四、纯化酵母菌的方法和操作过程
在微生物学中，将接种于 内，在合适条件下形成的含 的群体。
获得纯培养物的过程就是纯培养。
由 所获得的微生物群体。
分散的微生物(单一个体)在适宜的 表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的 。
形状、大小、光泽度、颜色、透明度等。
——是鉴定菌种的重要依据
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h。
①温度：培养基冷却至50℃左右；
②操作：在酒精灯火焰附近；
1.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
（2）接种和分离酵母菌
平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。
①接种环只蘸一次菌液，但要在培养基 不同位置连续划线多次；②划线首尾不能相接；③每次划线前接种环进行灭菌；④划线后，培养皿倒置培养。
划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次 划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
4.平板划线时最后一次划线为何不能与第一次划线相连？
最后一次划线已经将酵母菌稀释成单个细胞，如果与第一次划线相连，则增加了酵母菌数目，得不到纯化的效果。
5.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？ 在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
杀死接种环上原有微生物
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h。
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染
6.请回答下列与大肠杆菌有关的问题：(1)下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方。
该培养基属于 (填“固体”或“液体”)培养基，该培养基中的 氮源是 。(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和 培养皿进行　　 (填“消毒”或“灭菌”)；操作者的双手需要 进行清洗和　　 。
(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干支试管扎成一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入　　　 　　　　中灭菌，温度为121 ℃，时间为15～30 min。灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到大气压时，将试管取出。(4)从一支试管向另一支试管接种时应注意，接种环要在酒精灯 (填“火焰的不充分燃烧层”或“火焰的充分 燃烧层”)灭菌，并且待接种环　　 后蘸取菌种。
7.自然界里有多种微生物，将其进行合理的筛选、培养和应用，能给医药和化工等生产领域带来巨大经济效益。回答下列问题：(1)对培养基进行灭菌时，多采取 法，而对接种环或涂布器灭菌时则用 法，若要将微生物采用平板划线法进行分离操作，在固体培养基表面连续进行了5次划线，则需要对接种环灼烧 次。平板划线在做第二次及其以后的划线操作时，要从上次划线的 开始划线，最后一次划的线不能与第一次划的线 。(2)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温箱中 培养，以减少培养基中水分的挥发。其中，培养未接种的固体培养基是为了 。
高压蒸汽灭菌(湿热灭菌)
作为对照组，检验培养基是否被杂菌污染
在微生物学中，将允许 生长，同时 或 其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
能消除石油污染的微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
选择培养基与鉴别培养基
2.从用途上来讲，培养基二属于 培养 基，目的是为了获得 。 3.两种培养基共有的培养基成分有： 。 培养基一的碳源为 ，氮源为 ；培养基二的碳源为 ， 氮源为 。
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据__________________该类培养基的主要用途为 。
碳源、氮源、无机盐、水
由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进行 ，然后再将菌液 到制备好的 上。
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
两个基本操作： 和 。
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
①提供无机盐②调节pH。
2.对土壤样品进行稀释
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
①取0.1mL 菌液滴加 到培养基表面
②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
4.培养并观察培养基菌落
待涂布的菌液被 后，将平板 ，放入 中培养 d，在涂布有 菌液的平板上就可以观察到分离的 。
细菌一般选用104、105、106 稀释倍数的菌液进行涂布培养。
2.培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，为什么？未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键，如果无菌落生长，说明了什么？
培养未接种的培养基的作用是对照。未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。
1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时， 不要忽略；2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即 目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长 繁殖，所以还需要进一步验证；3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽， 然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的 烧杯中，以免引燃酒精。
常用微生物分离方法比较
1.间接计数法——稀释涂布平板法
当样品的稀释度足够 时，培养基表面生长的一个 ，来源于 中的一个 。通过计数平板上的 数，就能推测出样品中大约含有多少 。
样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目
①选择菌落数为 的平板计数。② 稀释度下，应 对 个平板进行重复计数， 然后求出 。③统计的菌落往往比活菌的实际数目 。④统计的结果一般用 而不是活菌数。
因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落。
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
每g样品中的菌落数＝
例题.某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
2.直接计数法——显微镜直接计数法
利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
①不能区分死菌和活菌→偏大。②不适于对运动细菌的计数。③个体小的细菌在显微镜下难以观察。
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
注意：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。 （“染色排除法”）
计数：测定分解尿素的细菌的数量
统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
（1）样品稀释与取样涂布
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液测放线菌：一般用103、104、105稀释液测真菌数：一般用102、103、104稀释液
注意事项： 本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）。
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
不一定，还需要进一步的鉴定
3.进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
呈碱性，遇酚红指示剂呈 色。
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
可以直接看液体的变色情况。
3.营养缺陷型菌株是野生型菌株经过人工诱变或自发突变失去合成某种成长因子的能力，只能在补充了相应的生长因子的基本培养基中才能正常生长的变异菌株。某研究小组对酵母菌用紫外线照射后将其接种到甲培养皿的培养基上，一段时间后将甲培养皿的菌落影印接种(不改变菌落位置)到乙、丙两培养皿的培养基中，进一步培养得到如下图所示结果。下列分析正确的是( )A.接种到甲培养皿采用的是 平板划线法B.甲、丙两培养皿中的培养基是基本培养基C.甲培养皿中菌落数有可能比接种的酵母菌数少D.甲、乙、丙三个培养皿都可能存在营养缺陷型菌落
4.某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用 的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是　　 。甲、乙培养基均属于_____培养基。
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释 倍。
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是：
S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：
取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即：
水、碳源、氮源和无机盐
5.解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是( )A.甲菌属于解脂菌B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
6.含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是（ ）A.乙菌的运动能力比甲菌强B.为不影响菌的运动需选用液体培养基C.该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量D.穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染