【同步讲义】高中生物（人教版2019）选修第三册--1.2《微生物的培养技术及应用（二）》讲义

《第1章  发酵工程》

第2节  微生物的培养技术及应用

二  微生物的选择培养和计数

必会知识 考点梳理拓展延伸易错警示

必会知识一  选择培养基

1．自然界中目的菌株的筛选

(1)原理：根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

(2)实例：DNA聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶。就是从水生栖热菌中分离出来的。

2．实验室中目的菌株的筛选

(1)原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

(2)方法：利用选择培养基分离。

①选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。

②选择培养基的设计原理：根据某种微生物对某种营养物质的特殊要求或者对某些特殊理化因素的抗性进行设计。

(3)典型实例：利用以尿素为唯一氮源的选择培养基分离土壤中分解尿素的细菌。

只有能够以尿素作为唯一氮源的微生物才能在该培养基上生长繁殖。

必会知识二  微生物的选择培养

1．将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。主要操作环节：系列稀释和涂布平板。

(1)系列稀释(梯度稀释)操作

①将分别盛有9mL无菌水的6支试管灭菌，并按1×102～1×107的顺序编号。

②用移液枪吸取1mL培养的菌液，注入1×102倍稀释的试管中。枪头插入液面下吸打几次，吸打时不用更换枪头，但是吸取上一级溶液时必须更换新的枪头。

③从1×102倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入1×103倍稀释的试管中，重复上一步的混匀操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。

(2)涂布平板操作

必会知识三  微生物的数量测定

1．稀释涂布平板法(活菌计数法)

(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数来推测样品中大约含有的活菌数。

(2)统计原则

①为了获得菌落数为30～300、适于计数的平板，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养；

②每个稀释度至少涂布3个平板，取其平均值(作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的可信度)。

(3)计算公式：每克样品中的菌株数=(C÷V)×M。C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数。

(4)结果分析：统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。因此统计结果一般用菌落数而不是用活菌数表示。

原因分析：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落：除此之外，在操作过程中，一些细菌会死亡，也会造成统计的菌落数偏低。

2．显微镜直接计数法

(1)原理：利用血细胞计数板(细菌计数板)，在显微镜下观察、计数、然后再计算一定容体的样品中微生物的数量。

(2)血细胞计数板：计数室有两种常见方格网，均有400小格，对于16(中)×25(小)的方格网而言，统计四角的4个中方格(共计100个小方格)中的个体数量；而对于25(中)×16(小)的方格网而言，统计四角和正中间的共5个中方格(共计80个小方格)中的个体数量，如图所示。

每个大方格的体积为0.1mm3(10﹣4mL)，故1mL培养液中细胞个数＝(中方格中细胞数/中方格中小方格数)×400×10×稀释倍数＝每小格平均细胞数×400×10×稀释倍数。

(3)结果分析：计数的结果比实际值偏大。因为显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。

3．其他方法—滤膜法

滤膜法可用来测定饮水中大肠杆菌的数量。将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红—亚甲蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现深紫色，可以根据培养基上深紫色菌落的数目，计算得出水样中大肠杆菌的数量。

必会知识四  土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验

1．实验步骤

2．实验中的无菌操作

(1)取土样的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。

(2)应在火焰旁称取土壤，并在火焰附近将土样倒入烧瓶中，塞好棉塞。

(3)在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

3．制订计划：对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作上做到有条不紊。例如：

第一天：进行实验器材的灭菌以及制备培养基的工作；

第二天：进行稀释涂布平板的操作；

第三、四、五天：进行实验结果的观察与记录。

4．结果分析与评价

5．菌种鉴定

(1)原理：细菌合成的脲酶能将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强，pH升高。因此，可通过检测培养基pH的变化来判断该化学反应是否发生。

(2)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

6．实验注意事项

(1)做好标记：实验中使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记。标记培养皿时应注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

(2)同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确，需重新进行实验。

(3)在一定的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，菌落的特征包括形状、大小、隆起程度、颜色等方面。

必备技能 典例精讲模型秒杀巧思妙解

必备技能一  选择培养基的

[例1](2022春·重庆·高二校联考期末)某同学想通过选择培养基分离以下生物，下列叙述错误的是(   )

A．欲筛选硝化细菌，培养基中无需有C源，但必须有N源

B．欲筛选分解尿素的细菌，培养基中必须有N源，可以无C源

C．欲筛选固氮菌，培养基中必须有C源，可以无N源

D．欲筛选分解纤维素的细菌，培养基中必须有C源和N源

必备技能二  单个的菌落形成

[例2](2022春·重庆·高二重庆市育才中学校考周测)下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的操作结果。下列叙述中正确的是(   )

A．甲涂布前要将涂布器灼烧，灼烧后直接取菌液

B．甲、乙操作都可用于微生物的计数

C．乙中接种环需要灼烧5次

D．乙中连续划线的起点是上一次划线的末端

必备技能三  酵母菌的纯培养

[例3](2023·全国·高三专题练习)酵母的蛋白含量高，可用作饲料蛋白，且有些酵母能利用工业废甲醇作为碳源进行繁殖，既可减少污染，又可降低成本。研究人员拟从土壤中分离该类酵母并大量培养，操作流程如下图。下列相关叙述正确的是(    )(注：25×16型血细胞计数板，表示计数室中有25个中格，每个中格又分成16个小格。)

A．实验前需对玻璃器皿、金属用具和培养基进行干热灭菌

B．只有③过程中使用的培养基需以甲醇作为唯一的碳源

C．为了保证结果准确，对每一个平板的菌落都要进行计数并取平均值

D．将发酵液稀释1000倍后，用25×16 ( 1mm×1mm×0．1mm)型血细胞计数板计数10个中格中的细胞数为60个，则发酵液中每毫升有1．5×10⁹个细胞

必备技能四  土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验

[例4](2022春·河北石家庄·高二石家庄市第四十一中学校考期中)关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是(　　)

A．利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度

B．若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照

C．该实验应采用稀释涂布平板法

D．用以尿素为唯一氮源的培养基来培养该细菌

必备技能五  分离土壤中能水解纤维素的微生物并观察菌落数

[例5](2022·浙江·模拟预测)刚果红能与纤维素形成红色复合物，但对纤维素水解后形成的纤维二糖和葡萄糖无作用。某同学利用刚果红配制选择培养基，分离土壤中能水解纤维素的微生物并观察菌落数。下列叙述正确的是(    )

A．划线接种后统计平板上的菌落数，统计值比活菌实际数高

B．选择培养基中应以刚果红作为唯一碳源，并加入琼脂糖作凝固剂

C．培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从电源插上开始计时

D．可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选目的菌

必备技能六  微生物的选择培养在实际生活以及科学研究中的应用

[例6](2022秋·安徽安庆·高三校考阶段练习)某种物质X(一种含有C、H、O、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解X。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解X的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和X，乙的组分为无机盐、水、X和Y。下列相关叙述中错误的是(　　)

A．甲、乙培养基均属于选择培养基，乙培养基组分中的Y物质是琼脂

B．步骤⑤的筛选过程中，各培养瓶中的X溶液要有一定的浓度梯度

C．若要筛选高效降解X的细菌菌株，甲、乙培养基中X是唯一的碳源

D．步骤⑤的筛选过程中，若培养基中的X浓度过高，某菌株对X的降解量可能下降

[例7](2022春·天津·高二校联考期末)嗜热菌又称高温细菌，是一类生活在火山口及其周围区域、温泉、工厂高温废水排放区等高温环境中的微生物。研究者从温泉中管选高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，其䖝选过程如图1所示。将得到的菌悬液转接于同时含有葡萄糖和淀粉作碳源的固体培养基上培养，得到若干菌落后用碘液作显色处理，结果如图2所示。下列说法错误的是(    )

A．热泉的高温状态淘汰了绝大多数的微生物保留了咾热菌

B．甲、乙试管为液体培养基，液体培养基能扩大培养水生噬热杆苗

C．丙中噬热菌数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和高温条件

D．图2中周围显蓝色的菌落含有所需的嗜热菌

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1．(2022秋·江苏镇江·高三江苏省镇江第一中学校联考阶段练习)幽门螺杆菌具有活性很高的脲酶，调查幽门螺杆菌感染可采用尿素呼气试验，用幽门螺杆菌的数量表示感染情况。现从待测人员体内采集样本并制成菌液后，按如下步骤进行分离培养，下列叙述正确的是(    )

A．灭菌之前应先将平板的pH调节至中性或弱酸性

B．图中X步骤可以使用平板划线法或稀释涂布平板法

C．目的菌接种到培养基后应立即将倒置的平板放入30~37℃恒温箱中

D．培养基中加入的酚红指示剂使平板上有的菌落周围出现红色透明圈

2．(2021秋·山西运城·高三校考开学考试)平板划线法和稀释涂布平板法是常用的两种接种方法。下列相关叙述中错误的是(　　)

A．平板划线法要求在培养基表面连续划线，且除第一次划线外，每一次划线的起点都是上一次划线的终点

B．除第一次划线前需要将接种环灼烧灭菌外，以后的划线可以不用灭菌

C．如果菌液本来浓度不高，则可以适当降低稀释倍数

D．“充分稀释”和“连续划线”的目的都是获得由单一细胞繁殖而成的菌落

3．(2022春·青海西宁·高二校联考期末)以下关于能分解尿素的细菌的说法，正确的是(　　)

A．能分解尿素的原因是能合成蛋白酶

B．用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基培养该菌后不会使酚红指示剂变红

C．环境中含有大量的尿素诱导该细菌产生了分解尿素的特性

D．分离该种细菌时以尿素作为唯一碳源

4．(2022春·四川·高二期中)在“分离土壤中分解尿素的细菌”实验中，为判断是否起到了分离效果，提高实验结果的可信度，需要精心设置对照。对照组的设置方式为(　　)

A．牛肉膏蛋白胨培养基上接种相同土壤样液

B．牛肉膏蛋白胨培养基上接种无菌水

C．筛选分解尿素细菌的选择培养基不接种

D．筛选分解尿素细菌的选择培养基上接种无菌水

5．(2022春·四川雅安·高二校考期中)下列关于纤维素分解菌分离实验的说法不正确的是(　　)

A．通常采用刚果红染色法筛选纤维素分解菌

B．从土壤中分离含量较多的微生物时，选择培养可以省略

C．该实验用到的是鉴别培养基

D．要从土壤中将分解纤维素的细菌分离出来，应该将它们接种在只有纤维素粉而无其他碳源的选择培养基上

6．(2022·四川绵阳·盐亭中学校考一模)利用微生物分解纤维素对废弃物污染的减轻和作物秸秆再利用具有重要意义。某兴趣小组从富含纤维素的土壤中取样，加入选择培养基中进行振荡培养，之后接种于鉴别培养基上进行培养，筛选出能够分解纤维素的微生物。下列叙述错误的是(　　)

A．选择培养的目的是促进纤维素分解菌生长，抑制其他微生物的生长

B．振荡培养可以增加溶解氧量，促进微生物对营养物质的充分接触和利用

C．鉴别培养基上涂布接种时，将1mL菌液滴到培养基表面再用涂布器涂布均匀

D．加入刚果红的鉴别培养基上出现透明圈的菌落，可能是能够分解纤维素的微生物

7．(2023·全国·高三专题练习)某生物兴趣小组把从固体培养基上分离出来的野生酵母菌接种到盛有等量同种液体培养基的三个相同锥形瓶中，并分别放在转速为2l0r/min、230r/min、250r/min的摇床上培养，得到如图所示结果，下列有关分析错误的是(    )

A．在固体培养基上分离所需菌种可以使用平板划线法

B．用血细胞计数板对培养液中酵母菌直接计数时，数值会偏小

C．在不同培养条件下相同锥形瓶内酵母菌种群的最大数量不同

D．实验结果出现不同的原因与培养过程中氧气的供应量有关

8．(2022春·河北沧州·高二任丘市第一中学校考期末)丙草胺是一种应用广泛的除草剂，能抑制土壤细菌、放线菌和真菌的生长。某生物兴趣小组从达活泉公园土壤中分离出能有效降解丙草胺的细菌菌株，并对其进行计数(如下图所示)，以期为修复被丙草胺污染土壤提供微生物资源。下列有关叙述错误的是(    )

A．将培养基pH调至酸性，有利于丙草胺降解菌的生长繁殖

B．除了用图中所示计数方法之外，还可用显微镜直接计数法，其计数结果往往比实际值偏大

C．用以丙草胺为唯一氮源的液体培养基进行培养可提高丙草胺降解菌浓度

D．通过计算得知每克土壤中的菌株数约为1.7×109个

40．(2022秋·山东青岛·高三山东省青岛第十七中学校考期中)自生固氮菌是土壤中能独立固定空气中 N2的细菌，将玉米种子用自生固氮菌拌种后播种，可显著提高产量并降低化肥的使用量。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如下图。回答下列问题：

(1)下表为两种培养基的配方，步骤④应选其中的__________________________培养基，原因是__________________________________________。

(2)步骤④所用的接种工具是_______________，若在④的平板上统计的菌落的平均数量为126 个，则每克土壤中含有的固氮菌为_____________个。

(3)将纯化的固氮菌置于完全培养液中扩大培养48小时，经离心后收集下层细胞并转移至特定培养基中进行固氮能力的测定，筛选出固氮能力最强的菌种CM12，为进一步鉴定其固氮能力，科研人员选用发芽一致的玉米种子进行3 组盆栽实验，30天后测定土壤微生物有机氮含量，结果如下图。

注：CK：对照处理组；N：尿素处理组(每盆土壤中 50mI有氮全营养液：成分为在 1000mL无氮植物营养液中加入 0.12g 尿素)；CM12：自生固氮菌CM12 处理组(每盆土壤浇 50 mL，接种自身固氮菌的无氮植物营养液)。

①对照组(CK)的处理为__________________________。

②实验结果表明：施用尿素处理和接种固氮菌 CM12 处理均能显著增加土壤微生物有机氮含量。与尿素处理组相比，CM12 处组土壤微生物的有机氮含量增加了大约_____%(保留1位小数)

③自生固氨菌较共生固氮菌(如根瘤菌)的应用范围更广，原因是__________________________。

10．(2022·甘肃张掖·高台县第一中学校考模拟预测)人工瘤胃模仿了牛、羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秤，提高秸秆的营养价值。为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究。请回答下列问题：

(1)平板划线法______________(填“能”或“不能”)用于实验室中分离纯化微生物。

(2)在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是______________(填序号)。

①酒精灯②培养皿③显微镜④无菌水⑤接种针

(3)若在倒平板过程中不小心在皿盖和皿底之间部位溅上培养基，则该培养皿不能再使用的原因是______________。

(4)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。研究人员在刚果红培养基平板上，筛选到了几株有透明降解圈的菌落(见图1)。图1中降解圈大小与纤维素酶的______________有关。图1中降解纤维素能力最强的菌株是①，依据是______________。

(5)研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4，在不同温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果如图2，推测菌株______________更适合用于人工瘤胃发酵，理由是______________。

(6)为进一步确定得到的是纤维素分解菌，可以对______________进行定量测定。