2023届高三生物一轮复习课件 基因工程1【工具】

这是一份2023届高三生物一轮复习课件 基因工程1【工具】，共47页。PPT课件主要包含了设想二，普通棉花，转基因抗虫棉，操作程序，29基因工程，基因工程，一概念P67，DNA模型剪切拼装，DNA重组技术，生物体外等内容，欢迎下载使用。
资料二 以往，治疗糖尿病的胰岛素是从动物胰腺中提取的，从100千克猪、牛等动物的胰腺只能提取3－4克胰岛素，治疗一个患者需宰杀40－50头牛，这种药物的造价就可想而知了。
微生物可以有分泌产物，且微生物繁殖速率快
能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？
资料三：我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中,常常会受到一些害虫的侵袭,其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一,严重时,甚至能使一片棉田绝收。大量施用农药杀虫不仅会提高生产成本,还可能造成农产品和环境的污染。
经过多年的努力，科学家于1973年证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，实现了物种间的基因交流。创立了可以定向改造生物的新技术——基因工程正式问世。
我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉就是在这样的背景下产生的。为什么传统的杂交育种方法培育不出抗虫棉,基因工程却可以呢?基因工程是如何进行操作的?
设想三：能不能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种。
世界上首只转基因猴Andy于2000年10月2日诞生在美国
一.概念科学探究：基因工程的诞生和发展二.原理：基因重组三.理论基础四.优点克服远缘杂交障碍可定向改造生物的性状五.工具1.限制酶——“分子手术刀”来源②特点③作用部位④作用结果2.DNA连接酶——“分子缝合针”作用②种类3.载体——“分子运输车”作用②种类③作为载体的条件科学探究：DNA的粗提取与鉴定
六.操作程序目的基因的筛选与获取科学思维：PCR技术获取和扩增目的基因概念、原理、目的、优点、操作环境、条件、过程、结果基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定探究实践： DNA片段的扩增及电泳鉴定七.应用八.第二代基因工程 ——蛋白质工程原理应用
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
大肠杆菌如何分泌人的胰岛素？
【不同物种的】基因重组
遗传物质都是DNA【物质基础】 DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸DNA都是独特的双螺旋结构基因是控制生物性状的独立遗传单位遗传信息的传递都遵循中心法则所有生物共用一套遗传密码
为什么传统的杂交育种方法培育不出抗虫棉,基因工程却可以呢?克服远缘杂交障碍可定向改造生物的性状
1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。1950年，埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格首次完成了对胰岛素氨基酸序列的测定。1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。1958年，梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。1961年，尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被成功破译。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
1970年，科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。1972年，伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功构建了第一个体外重组DNA分子。1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能。此后DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。1985年，穆里斯等人发明了PCR，为获取目的基因提供了有效手段。1990年，人类基因组计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术——CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
70番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。 DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
非转基因番木瓜(左）与转基因番木瓜(右）
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
基因表达载体的构建【核心】【体外完成】
1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
主要是从 中分离纯化出来的。
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。
只对外源DNA切割，不会切割自身的DNA。【原因可能是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰】
切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全
P71旁栏思考：推测限制酶存在于原核生物中的主要作用和特点？
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
（连接2个核苷酸之间的键）
EcRⅠ：大肠杆菌（Escherichia cli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。
用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌( Escherichia cli)的R型菌株分离来的，就用字母EcR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcRI。
P72 限制酶名字的由来
……G-A-A-T-T-C……
……C-T-T-A-A-G……
……A-A-G-C-T-T……
……T-T-C-G-A-A……
……G-G-A-T-C-C……
……C-C-T-A-G-G……
………T-C-G-A………
………A-G-C-T………
呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——_________和_______
①当限制酶在它识别序列的___________将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是__________；②当限制酶在它识别序列的________切开时，产生的是______；
实例1—EcRⅠ限制酶：识别序列为GAATTC，切割部位为GA之间的磷酸二酯键。
实例2——SmaⅠ限制酶： 识别序列为CCCGGG 切割部位为CG之间的磷酸二酯键。
写出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ____ EcRⅠ____ HindⅢ_____ BglⅡ ____
思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
以下黏性末端是由__种限制酶作用产生的
（相同的黏性末端可能是由不同限制酶作用形成的）
识别序列相同切割位点相同
练习使用EcRI获得目的基因
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
获得目的基因一般需要： 用限制酶切 刀、产生 个DNA片段、 个黏性末端
会产生相同的黏性(平)末端
如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？
第二种工具、分子缝合针—DNA连接酶
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
注意：用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键不是连接氢键 （氢键的形成不需要酶的催化）
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
都是蛋白质都是形成磷酸二酯键
需要模版单个核苷酸+片段形成单链
不需要模版片段+片段形成双链
与DNA分子相关的几种酶的比较
形成具有黏性末端或平末端的DNA片段
以单链DNA为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端，形成子代DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
以单链DNA为模板，将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端，形成单链RNA
既可以连接黏性末端，又可以连接平末端（但连接平末端的效率相对较低）
将外源基因送入受体细胞
质粒、噬菌体动植物病毒等。
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式不同可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
1.有一个至多个限制酶切割位点 目的：供外源DNA片段（目的基因）插入其中。2.能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上目的：随受体DNA同步复制。3.常有特殊的标记基因（如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等）目的：便于重组DNA分子的鉴定和筛选。4.对受体细胞无害，大小合适、方便操作。
选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来1.在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应选择的限制酶为______2.在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应选择的限制酶为______
注意：酶③也会切割酶②识别的序列，因此不能选择酶③
最常用的运载体——质粒
质粒是一种____的、结构简单的、独立于______________或_______________之外，并具有自我复制能力的____________分子
基因工程中使用质粒的特点：
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是天然质粒的基础上进行过_________的；这些质粒上常有特殊的标记基因，便于__________________；
利用标记基因进行筛选示例：
用EcRI重组DNA分子
注意事项：切割目的基因和载体时，需要用_____限制酶,目的是_____________目的片段可以自身环化吗？_____目的片段翻转过来，可以连接吗？____如何防止目的基因自身环化、防止目的基因反向连接到载体：
用两种不同的限制酶同时切割目的基因的两侧及质粒，使之产生不同的黏性末端。
下列操作中选用哪种限制酶切割构建重组DNA分子最好？（注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，ne表示新霉素抗性基因）
防止目的基因的自身环化；防止目的基因反向连接到载体
质粒、 噬菌体 、动植物病毒
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）
1.DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2ml/LNaCl溶液。3.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。【鉴定】
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
①研磨液②体积分数为95%的酒精③2ml/L 的NaCl溶液④二苯胺试剂⑤蒸馏水
——鉴定DNA，要现配现用
——定容至1000mL
——Tris、HCl、NaCl、EDTA、SDS等

称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
2.过滤或离心取上清液： 方法一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。 方法二：直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？ 可能含有核蛋白、多糖等杂质②4℃低温放置几分钟的作用： 抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； 抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
2.过滤或离心取上清液：
3.预冷酒精（95%）析出DNA或离心收集沉淀中的DNA 方法一：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
①搅拌时应轻缓、并沿一个方向： 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子②酒精预冷的作用：低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。 方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
3.预冷酒精（95%）析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定
取两支20mL的试管，各加入2ml/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关。
预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
NaCl溶液溶解DNA并鉴定
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？ 观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？ 可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。 本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？ 将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？ 利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。3.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？ 进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
课本P74 一、概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 ( ) A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2、在重组DNA技术中，将外源基因送人受体细胞的载体可以是（ ） A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C.DNA片段的黏性末 D.用来识别特定基因的DNA探针
课本P74 二、拓展应用
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子?
提示:迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源人侵的DNA降解。 细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA人侵
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindI、XbaI、EcRV和Xhl进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接?为什么?
提示: XbaI。 因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindI、XbaI、EcRV和Xhl进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义?
提示:识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断;这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。