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高考生物一轮复习重难点专项 专题53 微生物的实验室培养
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这是一份高考生物一轮复习重难点专项 专题53 微生物的实验室培养，文件包含专题53微生物的实验室培养教师版docx、专题53微生物的实验室培养学生版docx等2份试卷配套教学资源，其中试卷共77页， 欢迎下载使用。
高考一轮生物复习策略
1、落实考点。
一轮复习时要在熟读课本、系统掌握基础知识、基本概念和基本原理后，要找出重点和疑点；通过结合复习资料，筛选出难点和考点，有针对地重点复习。这就需要在掌握重点知识的同时，要善于进行知识迁移和运用，提高分析归纳的能力。
2、注重理论联系实际，高三生物的考试并不仅仅是考概念，学会知识的迁移非常重要，并要灵活运用课本上的知识。
不过特别强调了从图表、图形提取信息的能力。历年高考试题，图表题都占有比较大的比例。那些图表题虽不是教材中的原图，但它源于教材而又高于教材，是对教材内容和图表的变换、深化、拓展，使之成了考查学生读图能力、综合分析能力、图文转换能力的有效途径。
3、一轮复习基础知识的同时，还要重点“攻坚”，突出对重点和难点知识的理解和掌握。
这部分知识通常都是学生难于理解的内容，做题时容易出错的地方。分析近几年的高考生物试题，重点其实就是可拉开距离的重要知识点。
4、学而不思则罔，思而不学则殆。
这一点对高三生物一轮复习很重要。尤其是对于错题。错题整理不是把错题抄一遍。也不是所有的错题都需要整理。
专题53 微生物的实验室培养
1．培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。
(3)种类
①按照物理性质可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。
②按照成分的来源可分为天然培养基和合成培养基。
③按照功能用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。
2．无菌技术
(1)含义：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
(2)常用方法
3．大肠杆菌的纯化培养
(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
→→→→
(2)纯化大肠杆菌的方法
①平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
特别提醒 a．操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：
第一次操作
每次划线之前
划线结束
目的
杀死接种环上原有的微生物
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
b.灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
c．第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
d．划线时最后一区不要与第一区相连。
e．划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
②稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
(3)菌种的保存方法
①对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
②对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
解题技巧
1．培养基的配制原则
(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
(3)pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需的pH不同。
2．微生物对主要营养物质的需求特点
(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。
(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。
两种纯化细菌方法的比较
项目
优点
缺点
适用范围
平板划线法
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
不能计数
适用于
好氧菌
稀释涂布平板法
可以计数，可以观察菌落特征
吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
一、单选题
1．下列无菌操作错误的是（ ）
A．取出已经过灭菌的物品时，容器盖勿全开，能方便取出即可
B．取出已经过灭菌的物品，如未使用，应立即放回
C．疑有污染或己被污染时，应更换或重新灭菌
D．手持无菌容器时应托住底部，手只能触及容器边缘
【答案】B
【分析】
在微生物的实验室培养中获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下几个方面：
1、对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；
2、将用于微生物培养的培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；
3、为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；
4、实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。
【详解】
A、周围物品可能会含有杂菌，为防止杂菌污染，无菌技术操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品的接触，取出已经过灭菌的物品时，容器盖勿全开，能方便取出即可，A正确；
B、取出已经过灭菌的物品，如未使用，不应立即放回，会污染其他物品，B错误；
C、疑有污染或己被污染时，应更换或重新灭菌，达到无菌的要求，C正确；
D、手持无菌容器时应托住底部，手只能触及容器边缘，防止污染无菌容器，D正确。
故选B。
2．氢气是一种清洁能源，可由产氢菌群无氧发酵产生。科研人员从厌氧活性污泥中获得产氢菌群，在分离、纯化产氢菌群的操作中，为防止杂菌污染，对培养皿、接种环、涂布器，培养基等都可采用下列哪种方法处理? （ ）
A．巴氏消毒法 B．灼烧灾菌
C．干热灭菌 D．高压蒸汽灭菌
【答案】D
【分析】
实验室常用的灭菌方法：
1、灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌，此外，在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰燃烧来灭菌。
2、干热灭菌：能耐高温的，需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌。
3、高压蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121℃的条件下，维持15～30 min。
【详解】
培养基不能通过灼烧灭菌和干热灭菌的方法进行灭菌，玻璃器皿（吸管、培养皿）一般不用灼烧灭菌的方法灭菌，而巴氏消毒法是指在75℃煮30min或80℃煮15min进行杀菌，属于消毒；故在分离、纯化产氢菌群的操作中，为防止杂菌污染，对培养皿、接种环、涂布器，培养基等都可采用高压蒸汽灭菌方法处理，即D符合题意。
故选D。
3．高温灭菌的原理是（ ）
A．微生物对高温环境不适应
B．高温降低了环境中氧的浓度
C．每种微生物生长的最适温度是一定的
D．高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动
【答案】D
【分析】
高压蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121℃的条件下，维持15～30 min。
【详解】
蛋白质和核酸是细胞表现生命活动的最重要物质，它们都是高分子化合物，具有复杂的空间结构，高温能使他们的空间结构受到破坏而失去活性，所以高温灭菌的原理是高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动，故选D。
4．下列操作不需要在酒精灯火焰旁进行的是（ ）
A．土壤取样 B．平板划线
C．稀释土壤溶液 D．涂布平板
【答案】A
【分析】
无菌技术的主要内容：①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
【详解】
酒精灯火焰附近存在一个无菌区，平板划线、稀释土壤溶液、涂布平板操作都需要在酒精灯火焰附近进行，以免杂菌污染；土壤是微生物的土壤培养基，土壤取样时不需要在酒精灯旁操作，A符合题意。
故选A。
5．牛奶消毒及细菌检测实验的过程如下图所示，下列相关叙述正确的是（ ）
A．步骤①为巴氏消毒法，这种方法可以杀死所有的微生物以及芽孢和孢子
B．实验中试管、培养基可采用热灭菌
C．实验中采用稀释涂布平板法计数，可能导致实验结果偏高
D．稀释涂布平板法操作中涂布器需经灼烧灭菌冷却后再涂布
【答案】D
【分析】
巴氏消毒法：采用较低温度(一般在60～82℃)，在规定的时间内，对食品进行加热处理，达到杀死微生物营养体的目的，是一种既能达到消毒目的又不损害食品品质的方法。获取纯净培养物的关键是防止外来杂菌污染。
【详解】
A、①为巴氏消毒法，不能杀死所有芽孢和孢子，A错误；
B、实验中试管用干热灭菌，培养基用高压蒸汽灭菌，B错误；
C、采用稀释涂布平板法计数，可能导致实验结果偏低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，C错误；
D、稀释涂布平板法操作中涂布器需经灼烧灭菌冷却后再涂布，防止烧伤菌种，D正确。
故选D。
6．在三个培养皿中各加入等量但不同种的大肠杆菌培养基，在培养皿中培养 36 小时后，统计大 肠杆菌的菌落数（如表）。下列表述错误的是（ ）
培养皿
培养基成分
菌落数/个
Ⅰ
琼脂、糖类
35
Ⅱ
琼脂、糖类和维生素
250
Ⅲ
琼脂和维生素
0
A．本实验使用的是固体培养基
B．对照培养皿Ⅰ和Ⅱ，说明维生素是大肠杆菌需要的生长因子
C．对照培养皿Ⅱ和Ⅲ，说明糖类是大肠杆菌需要的碳源
D．对照培养皿Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，说明琼脂是培养基中必需的营养成分
【答案】D
【分析】
1、培养基的基本成分：水、无机盐、碳源、氮源。
2、实验设计的原则有单一变量原则和对照原则。该实验设置的自变量是培养基中糖类和维生素的有无，因变量是培养基中的菌落数。为了确保实验结果只是由自变量的不同引起的，应当使对照实验中的实验组和对照组所处的温度等环境条件都相同。
【详解】
A、本实验添加了琼脂，使用的是固体培养基，A正确；
B、培养皿Ⅰ和Ⅱ的区别在于是否添加维生素，结果I中菌落数少于II中，说明维生素是大肠杆菌需要的生长因子，B正确；
C、培养皿Ⅱ和Ⅲ的区别在于是否添加糖类，结果II中的菌落数多而III中无菌落，说明糖类是大肠杆菌需要的碳源，C正确；
D、培养基的基本成分：水、无机盐、碳源、氮源，琼脂是凝固剂，不是营养成分，D错误。
故选D。
7．漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是（ ）
A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品
B．选择培养基中需要加入漆酶的底物作为唯一碳源
C．在已涂布的平板上直接划线可以进一步纯化获得单菌落
D．斜面培养基中含有大量营养物质，可在常温下长期保存菌株
【答案】B
【分析】
稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。
用途：一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养基的回收率计数。
优点：可以计数，可以观察菌落特征。
缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的话，长不出单菌落。
【详解】
A.生活污水中含有大量微生物，而漆酶属于木质降解酶类，因此污水中不一定含有产漆酶的菌株，A错误；
B.选择培养基中需要加入漆酶的底物作为唯一碳源，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落，从而获得漆酶菌株，B正确；
C.划线前需要将接种环进行灭菌，且利用平板划线法需要连续划线，才能逐渐分离得到单菌落，C错误；
D.短期保存可利用试管斜面培养基，在0-4℃冰箱中保存，长期保存菌株是在-20℃用甘油管藏，D错误。
故选：B。
8．如图是实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤。下列说法错误的是（ ）
A．①步骤使用的培养基已经高温高压蒸汽灭菌且冷却至50℃左右
B．②过程挑取菌种前后试管口均需通过火焰
C．③所示的接种方法不能用来进行细菌计数
D．④操作过程中，需灼烧接种环5次
【答案】D
【分析】
如图是实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，①是倒平板，②是用接种环沾取菌液，③是进行平板划线，④是培养。
【详解】
A、①步骤表示倒平板，使用的培养基已经高温高压蒸汽灭菌且冷却至50℃左右，A正确；
B、②过程挑取菌种前后试管口均需通过火焰，防止被杂菌污染，B正确；
C、③是进行平板划线，平板划线法开始得到的菌体是连在一起生长的，故该方法不能用于计数活菌，只能用于分离菌种，C正确；
D、接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以完成步骤④中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，完成步骤④共需灼烧接种环6次，D错误。
故选D。
9．生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需生长因子的种类，某研究小组把该菌的悬浮液与不含任何生长因子但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒成平板，然后在平板上划分数区，将甲、乙、丙三种生长因子分别添加到不同区域，培养结果如图所示，下列说法正确的是（ ）
A．本实验不需要另外设置对照实验
B．图示结果表明该菌需要生长因子乙或丙
C．平板中添加完生长因子，待冷凝后需倒置培养
D．实验结束后，使用过的培养基必需消毒后倒掉
【答案】C
【分析】
把某嗜热菌的悬浮液与不含任何生长因子但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒成平板，然后在平板上划分数区，将甲、乙、丙三种生长因子分别添加到不同区域，据图可知，只在乙和丙交接处有微生物生长。
【详解】
A、本实验需要设置空白对照，判断培养基配制是否合理，及没有生长因子时的生长状况，A错误；
B、由于只在乙和丙交接处有微生物生长，可判断该菌生长需要的生长因子是乙和丙，B错误；
C、为了防止形成的冷凝水滴落在培养基上造成杂菌污染和培养基的水分过快蒸发，平板要倒置培养，C正确；
D、实验结束后，使用过的培养基应该灭菌后再倒掉，消毒不一定能完全杀死孢子和芽孢，D错误。
故选C。
10．下列有关倒平板的操作，正确的是（ ）
A．培养基冷却到常温再进行倒平板
B．培养皿打开后培养皿盖倒放在桌面上
C．整个倒平板操作过程无需在酒精灯火焰旁进行
D．待平板冷却凝固后需要倒过来放置
【答案】D
【分析】
倒平板操作的步骤：将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞；右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰；用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖；等待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置，使皿盖在下、皿底在上，这样可以防止皿盖上的水分滴到培养基上造成培养基的污染。
【详解】
A、已灭菌的培养基冷却到大约50℃时可倒平板，A错误；
B、应将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌子上，这样可能会造成杂菌污染，B错误；
C、倒平板过程需要在酒精灯火焰旁进行，防止空气中的杂菌污染，C错误；
D、待平板冷却凝固后需要倒过来放置，防止皿盖上的水珠滴落到培养基上，D正确。
故选D。
11．下列关于灭菌和消毒的叙述中，不正确的是（ ）
A．灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子
B．消毒和灭菌实质上是相同的
C．接种环用灼烧法灭菌
D．常用灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
【答案】B
【分析】
使用强烈的理化因素杀死物体内外一切微生物的细胞、芽孢和孢子的过程称为灭菌，常用的方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。消毒是指用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体体表或内部的一部分微生物的过程，常用的方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法等。
【详解】
A、灭菌是指采用强烈的理化因素杀死一定环境中所有微生物的细胞、芽孢和孢子的措施，是彻底杀死，A正确；
B、消毒是一种采用较温和的理化因素杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒物体基本无害的措施，是部分杀灭，故消毒和灭菌实质上不相同， B错误；
C、接种环用灼烧法灭菌，C正确；
D、常用灭菌方法有灼烧法、干热灭菌法、高压蒸汽灭菌法，D正确。
故选 B。
12．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧、干热灭菌等几种不同的处理，这些方法依次用于杀死哪些部位的杂菌（ ）
A．接种环、手、培养基、涂布器 B．高压锅、手、接种环、培养基
C．培养基、手、接种环、试管 D．接种环、手、高压锅、培养皿
【答案】C
【分析】
消毒是使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子）；杀菌是使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）。
【详解】
高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌；用酒精擦拭双手是消毒的一种方法；火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环、接种环等金属用具；干热灭菌一般适用于玻璃器皿的灭菌，如试管。C符合题意。
故选C。
13．下表所示为某微生物培养基的配方，有关叙述错误的是（ ）
成分
含量
成分
含量
NaNO3
3 g
FeSO4
0．01 g
K2HPO4
1 g
(CH2O)
30 g
琼脂
15 g
H2O
1 000 mL
MgSO4·7H2O
0．5 g
青霉素
0．1万单位
A．依物理性质划分，该培养基属于固体培养基；依用途划分，该培养基属于选择培养基
B．本培养基中青霉素的添加满足了微生物生长对特殊营养物质的要求
C．由培养基的原料可知，所培养的微生物可以是酵母菌或毛霉，其同化作用类型是异养型
D．若用该培养基分离能分解尿素的细菌，应除去青霉素和NaNO3，并应加入尿素
【答案】B
【分析】
各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。培养基按其特殊用途可分为加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。液体培养基中加入凝固剂琼脂可以制作固体培养基。
【详解】
A、从培养基成分看，配方中含有有琼脂等凝固剂，属于固体培养基；依用途划分，该培养基中加入青霉素，因此属于选择培养基，A正确；
B、本培养基中青霉素的添加是为了筛选能够抗青霉素的微生物，而非满足微生物生长对特殊营养物质的要求，B错误；
C、由培养基的原料可知，葡萄糖属于有机碳源，因此所培养微生物的同化作用类型是异养型，培养的微生物可以是酵母菌或毛霉，C正确；
D、若用该培养基分离能分解尿素的细菌，应以尿素为唯一氮源，故应除去青霉素和NaNO3，并应加入尿素，D正确。
故选B。
14．下列关于微生物培养及利用的叙述，正确的是（ ）
A．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物
B．酵母菌酿酒时，不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒
C．果胶经过果胶酶和果胶甲酯酶水解后的产物是半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯
D．尿素固体培养基在灭菌并完全冷却后再加入经过滤灭菌的尿素溶液
【答案】B
【分析】
果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一.它是由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物，不溶于水，果胶酶能够分解果胶，瓦解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁变得更容易。果胶酶并不特指某一种酶，而是分解果胶的一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶等。
【详解】
A、尿素固体培养基上只有能利用尿素的微生物可以正常生长，但不能迅速杀死其他微生物，A错误；
B、酵母菌酿酒时，只能利用糯米淀粉分解产生的葡萄糖发酵得到糯米酒，B正确；
C、果胶经过果胶酶和果胶甲酯酶水解后的产物是半乳糖醛酸和甲醇，C错误；
D、制备尿素固体培养基时，在加入尿素溶液后再灭菌，D错误。
故选B。
15．下列对菌落的表述不正确的是（ ）
A．并不是所有培养基上都能形成菌落
B．菌落的形状、大小、颜色等，可作为鉴别不同微生物的依据
C．一般情况下，培养基上的一个菌落可看做是一个种群
D．培养基上的每个菌落都是由单个菌体细胞大量繁殖而成
【答案】D
【分析】
菌落是指由微生物的一个细胞在或一堆同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的子细胞群体。
【详解】
A、菌落是在固体培养基上形成的，因此并不是所有培养基上都能形成菌落，例如液体培养基，A正确；
B、菌落的特征，如形状、大小、颜色等，可作为鉴别不同微生物的依据，B正确；
C、一般情况下，培养基上的一个菌落是由单个细胞经过分裂形成的，是同种生物，可看做是一个种群，C正确；
D、培养基上的菌落也可能是由2个或多个连在一起的菌体细胞大量繁殖而成的，D错误。
故选D。
16．某同学在做“微生物的分离与培养”实验时，下列灭菌方法中，操作正确的是（ ）
A．在高压蒸汽灭菌锅外层锅内加适量水，放入装有待灭菌物品的内桶，关闭排气阀，打开电源加热
B．在干热灭菌箱灭菌结束后，立即关掉电源，打开箱门，取出物品
C．采用紫外线照射灭菌时，可在物体表面喷洒适量石碳酸等化学抑菌剂，以加强消毒效果
D．在用灼烧法对接种环灭菌时，适当向灼烧后的接种环吹气，以加速其冷却
【答案】C
【分析】
实验室常用的灭菌方法：
1、灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌，此外，在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰燃烧来灭菌。
2、干热灭菌：能耐高温的，需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌。
3、高压蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121℃的条件下，维持15～30 min。
【详解】
A、在高压蒸汽灭菌锅外层锅内加适量水，放入装有待灭菌物品的内桶，打开电源加热，把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后，关闭排气阀，将锅密闭，A错误；
B、在干热灭菌箱灭菌结束后，立即关掉电源，等温度下降至室温后再打开箱门，取出物品，B错误；
C、采用紫外线照射灭菌时，可在物体表面喷洒适量石碳酸等化学抑菌剂，可以加强消毒效果，C正确；
D、在用灼烧法对接种环灭菌时，可将灼烧后的接种环接触菌种瓶内壁，以加速其冷却，D错误。
故选C。
17．下列能用固体培养基进行直接计数的是（ ）
A．一种癌细胞 B．浓缩培养的噬菌体 C．大肠杆菌 D．菊花组织细胞
【答案】C
【分析】
固体培养基可用于微生物的培养和计数，培养液中的细胞可用血细胞计数板进行计数。
【详解】
A、癌细胞培养液中的癌细胞可以用血细胞计数板直接计数，不能用培养基直接计数，A错误；
B、噬菌体是病毒，不能用培养基培养，在光学显微镜下不能观察到，B错误；
C、固体培养基上的大肠杆菌菌落可以直接用肉眼观察到，可以在固体培养基上直接计数，C正确；
D、菊花组织细胞中的细胞都连接在一起，无法直接计数，D错误。
故选C。
18．下列关于微生物培养基营养成分和作用的叙述，正确的是（ ）
A．微生物培养基只含有水、碳源、氮源和无机盐
B．蛋白胨能为微生物提供磷酸盐
C．牛肉膏能为微生物提供特殊营养物质
D．铵盐、硝酸盐是异养微生物的主要氮源
【答案】C
【分析】
培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；根据物理性质分为固体培养基和液体培养基，培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物种和氧气的要求。
【详解】
A、微生物培养基的配方中，一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有些培养基还需要加入一些特殊营养物质，A错误；
B、蛋白胨提供的主要营养有碳源、氮源和维生素，但不能提供磷酸盐，B错误；
C、牛肉膏提供的主要营养有碳源、氮源、磷酸盐和维生素，能提供特殊营养物质维生素，C正确；
D、异养微生物的主要氮源是有机氮源，D错误。
故选C。
19．下列操作属于灭菌方法的是（ ）
A．接种前用酒精棉球擦拭双手和工作台面
B．接种时将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中，并将涂布器放在火焰上灼烧
C．牛奶在80℃下煮15min以杀死其中的微生物
D．接种室用此紫外线照射30min以杀死物体表面或空气中的微生物
【答案】B
【分析】
灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外一切微生物的细胞、芽孢和孢子的过程，常用的方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌；消毒是指用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体体表或内部的一部分微生物的过程，常用的方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法等。
【详解】
A、接种前用酒精棉球擦拭双手和工作台面属于消毒，A不符合题意；
B、进行涂布平板操作前，要对涂布器进行灭菌，一般做法是先将涂布器浸在盛有70%酒精的烧杯中，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，属于灭菌，B符合题意；
C、牛奶在80℃下煮15min以杀死其中的绝大多数微生物属于消毒，C不符合题意；
D、接种室在使用前要进行紫外线照射照射30min，以杀死物体表面和空气中的微生物，属于消毒，D不符合题意。
故选B。
20．某科研小组用滤膜法测定饮用水中大肠杆菌的含量（所用滤膜孔径小于大肠杆菌）。下列叙述正确的是（ ）
A．大肠杆菌在含有酚红指示剂的培养基上培养得到的菌落呈红色
B．可根据培养基上红色菌落的数目估算出水样中大肠杆菌的数量
C．将滤膜转移培养后统计出的菌落数目往往比活菌的实际数目要多
D．血清、毒素、抗生素等不耐热生物制品可以采用滤膜过滤除去细菌
【答案】D
【分析】
滤膜法是检测水样中大肠杆菌群的方法；将一定量水样注入已灭菌的微孔薄膜的滤器中，经过抽滤，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴于伊红美蓝培养基（EMB培养基）上，经培养后计数和鉴定滤膜上生长的大肠杆菌菌落，依据过滤水样体积计算每升或每100毫升水样中的大肠杆菌菌群数；该方法操作简单、快速，主要适用于杂质较少的水样。
【详解】
A、大肠杆菌在含有伊红美蓝的培养基表面长出的菌落呈黑色，A错误；
B、将已知体积的饮用水过滤后，将滤膜放在加入伊红美蓝的培养基上（大肠杆菌菌落呈黑色），根据黑色菌落的数目，可计算出水样中大肠杆菌的数量，B错误；
C、将滤膜转移培养后统计菌落数目时，由于培养过程中两个或多个细胞可能生长在一起形成一个菌落，导致统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，C错误；
D、滤膜法经过抽滤，细菌被截留在滤膜上，故血清、毒素、抗生素等不耐热生物制品可以采用滤膜过滤除去细菌，D正确。
故选D。
21．如图是“微生物平板划线”示意图，划线的顺序为1→2→3→4→5，下列有关叙述正确的是（ ）
A．操作前用无水乙醇对接种人员的双手进行消毒处理
B．划线操作时，把培养皿盖完全打开后在酒精灯火焰上方进行
C．在5个区域中，最好选择最后区域的菌落
D．划线前后灼烧接种环的目的相同
【答案】C
【分析】
平板划线的操作的基本步骤是：
1、右手持接种环，经火焰灭菌，待凉后，在火焰旁打开盛有菌液的试管棉塞，并将试管口过火焰，将以冷却的接种环伸入菌液，沾取一环菌液，将试管口过火焰丙塞上棉塞。
2、左手斜持琼脂平板，皿盖打开一条缝，右手于火焰近处将接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖，接种环不应划破培养基表面。
3、烧灼接种环，杀灭环上残留菌液，待冷却（是否冷却，可先在培养基边缘处试触，若琼脂溶化，表示未凉，稍等再试），从第一区域划线的末端开始往第二区内划线，重复以上操作，在第三四五区内划线，注意不要将最后一区的划线与第一区相连。
4、将平板倒置，放入培养箱中培养。
【详解】
A、操作前用70%的酒精溶液对接种人员的双手进行消毒处理，A错误；
B、划线操作时，培养皿盖不要完全打开，且须在酒精灯火焰周围进行，以防空气中杂菌污染，B错误；
C、在5个区域中，最后区域更容易获得单个活细菌形成的菌落，故最好选择最后区域的菌落，C正确；
D、初次划线灼烧的目的是防止杂菌污染，其后划线后灼烧的目的是杀死上次划线结束后残留在接种环上的菌种，使下一个区域的菌种只来自上一个区域的末尾，最后一次灼烧的目的是防止菌体污染环境，故划线前后灼烧接种环的目的不相同，D错误。
故选C。
22．下列有关细菌纯培养的说法，不正确的是（ ）
A．每次划线后接种环要在酒精灯火焰上灼烧灭菌
B．培养基上的单个菌落都是一个细菌细胞的克隆
C．实验操作者接种前要用70%的酒精棉球擦手消毒
D．菌液梯度稀释后用涂布法接种，得到单菌落便于计数
【答案】B
【分析】
1、无菌技术的主要内容：
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；
③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
2、微生物常见的接种的方法：
①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
A、为杀死接种环上残留的菌种，每次划线后接种环要在酒精灯火焰上灼烧灭菌，A正确；
B、培养基上的单个菌落都是一个细菌细胞或几个同种细菌细胞的克隆，B错误；
C、对操作者的衣着和手要进行消毒，一般接种前要用70%的酒精棉球擦手消毒，C正确；
D、菌液梯度稀释后用涂布法接种，得到单菌落便于计数，D正确。
故选B。
23．在农田土壤的表层自生固氮菌较多，用表层土制成的稀泥浆接种到特制的培养基上培养，可将自生固氮菌与其他细菌分开，对培养基的要求是（ ）
①加抗生素 ②不加抗生素 ③加氮素 ④不加氮素 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦39℃恒温箱中培养 ⑧28～30℃恒温箱中培养
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧ C．②④⑤⑧ D．②④⑥⑦
【答案】C
【分析】
1、自生固氮微生物属于细菌，其细胞壁的主要成分是肽聚糖，对抗生素敏感。
2、自生固氮微生物是一类能够独立进行固氮的微生物。
3、自生固氮微生物的代谢类型是异养需氧型。
【详解】
①②自生固氮微生物属于细菌，其细胞壁的主要成分肽聚糖，对抗生素敏感，培养基不能添加抗生素，①错误，②正确；
③④自生固氮微生物是一类能够独立进行固氮的微生物，培养基中可以不添加氮素，③错误，④正确；
⑤⑥自生固氮微生物的代谢类型是异养需氧型，培养基必须添加葡萄糖作为碳源和能源，⑤正确，⑥ 错误；
⑦⑧应在28°C～30°C温度下培养，这是因为该温度是自生固氮微生物的最适宜温度，⑦错误，⑧正确。
综上所述②④⑤⑧，ABD错误，C正确。
故选C。
24．菜籽粕含有35%~45%蛋白质，是畜禽饲料的重要原料，但其中的单宁等抗营养因子限制了菜籽粕的应用。研究者将不同菌种接种到菜籽粕与麸皮制成的固体培养基中发酵48h，测定菜籽粕中单宁的含量，结果如图。下列相关叙述错误的是（ ）
A．菜籽粕与麸皮为微生物提供碳源和氮源
B．接种后需对培养基进行高压蒸汽灭菌
C．黑曲霉菌对单宁的去除效果最为理想
D．实验所用菌种均有细胞壁但成分不同
【答案】B
【分析】
由柱形图分析可知，4种菌种处理的发酵菜籽粕中的单宁含量都低于对照组，去除单宁效果由大到小的排序为黑曲霉菌＞植物乳酸菌＞酿酒酵母菌＞枯草芽孢杆菌。
【详解】
A、菜籽粕含有较多的粗蛋白和维生素等物质，麦麸含有粗纤维、蛋白质和微量元素，故菜籽粕与麸皮能够为微生物提供碳源和氮源，A正确；
B、接种前的培养基需要进行高压蒸汽灭菌，培养基的制作过程为：计算、称量、溶化、调pH、灭菌、倒平板，B错误；
C、由柱形图分析可知，黑曲霉处理的发酵菜籽粕中的单宁含量最低，由此说明黑曲霉菌对单宁的去除效果最为理想，C正确；
D、实验用的植物乳酸菌和枯草芽孢杆菌是原核生物，细胞壁主要成分是肽聚糖，酵母菌细胞壁的主要成分是葡聚糖和甘露聚糖，黑曲霉菌细胞壁的主要成分是几丁质，D正确。
故选B。
25．在分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种（甲）、培养结果（乙）如下图，有关叙述正确的是 （ ）
A．在第c区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
B．划线操作时，如不划线操作时，如接种环不慎划破培养基，可以继续正常操作
C．接种过程中至少需要对接种环灼烧6次
D．甲中d区域为划线的起始位置
【答案】D
【分析】
平板划线的操作的基本步骤是：
1、右手持接种环，经火焰灭菌，待凉后，在火焰旁打开盛有菌液的试管棉塞，并将试管口过火焰，将以冷却的接种环伸入菌液，沾取一环菌液，将试管口过火焰丙塞上棉塞。
2、左手斜持琼脂平板，皿盖打开一条缝，右手于火焰近处将接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖，接种环不应划破培养基表面。
3、烧灼接种环，杀灭环上残留菌液，待冷却（是否冷却，可先在培养基边缘处试触，若琼脂溶化，表示未凉，稍等再试），从第一区域划线的末端开始往第二区内划线，重复以上操作，在第三四五区内划线，注意不要将最后一区的划线与第一区相连。
4、将平板倒置，放入培养箱中培养。
【详解】
A、在第c区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于第一区域的划线末端，A错误；
B、划线操作时，如接种环不慎划破培养基，则该培养基将不能继续使用，B错误；
C、每次划线前后都需要将接种环灼烧灭菌，因此按照图中划线顺序（d→c→b→a），整个划线过程需要对接种环灼烧5次，C错误；
D、每次划线的菌种来自上一区域的末端，因此划线的起始区域菌落最多，由图乙可知，图甲中的d区域菌落多，为划线的起始位置，D正确。
故选D。
26．漆酶属于木质素降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述不正确的是 （ ）
A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品
B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落
C．在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化
D．斜面培养基中含有大量营养物，可在低温下临时保存菌株
【答案】A
【分析】
1、分析题图：分离、纯化和保存菌株的一般过程为：取样→制成样品悬液→涂布→划线→接种。
2、分离和纯化细菌需多次进行选择培养。
3、利用平板划线法纯化目的菌时，在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环。
【详解】
A、根据题意可知，漆酶属于木质降解酶类，因此森林的土壤是分离产漆酶菌株的首选样品，生活污水中含有大量微生物，但不一定含有产漆酶的微生物，A错误；
B、产漆酶能分解木质素，筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落，从而获得漆酶菌株，B正确；
C、平板划线法可以用来分离和纯化微生物，在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化，C正确；
D、保存菌种一般在低温下保存，将菌株接种于固体斜面培养基，菌落长成后可在4℃的冰箱中临时保藏，D正确。
故选A。
27．某学生为了观察根瘤菌（共生固氮菌：只有共生才能固氮）的菌落形态，做了两组实验；A组把根瘤菌接种到无氮培养基中，其他营养成分均齐全；B组把根瘤菌接种到全素培养基中（各种营养成分均齐全）。两组根瘤菌的固氮量与菌落的情况是（ ）
A．A组的固氮量与菌落比B组的多且大 B．B组的固氮量与菌落比A组的多且大
C．A组的固氮量与菌落大小与B组几乎一样 D．A、B组均不能固氮，B组能形成菌落
【答案】D
【分析】
分析题意可知，本实验的自变量为氮元素的有无，因变量为菌落的生长状况，其余无关变量应保持等量且适宜，据此分析作答。
【详解】
因共生固氮菌只有和其它生物，如和豆科植物共生形成根瘤后才能固氮，故A组把根瘤菌接种到无氮培养基中，其B组把根瘤菌接种到全素培养基中，因缺少共生物，两组均不能固氮，但B组营养齐全，可以形成菌落。D符合题意。
故选D。
28．甲、乙、丙是三种微生物，下表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖；甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是（ ）
粉状硫
10 g
K2HPO4
4 g
FeSO4
0.5 g
蔗糖
10 g
（NH4）2SO4
0.4 g
H2O
100 mL
MgSO4
9.25 g
CaCl2
0.5 g
Ⅰ
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
Ⅱ
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
＋
Ⅲ
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
注：“＋”表示培养基中加入了这种物质，“－”表示培养基中没有加入这种物质。
A．甲、乙、丙都是异养型微生物
B．甲、乙都是自养型微生物，丙是异养型微生物
C．甲是异养型微生物，乙是固氮微生物，丙是自养型微生物
D．甲是固氮微生物，乙是自养型微生物，丙是异养型微生物
【答案】D
【分析】
据表分析：Ⅰ培养基的特点是缺氮，能在这样的培养基上存活的只能是固氮微生物；Ⅱ培养基的特点是没有有机碳源，是培养自养微生物的培养基；Ⅲ培养基是适宜异养微生物生长的培养基。
【详解】
根据题意可知，甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能，而Ⅰ培养基缺氮，说明甲能够自身固氮，属于固氮微生物；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，而甲和丙都不能，Ⅱ培养基中没有有机碳源，说明乙能够合成有机物，属于自养微生物；而丙不能在Ⅰ培养基，说明不能固氮；又不能在Ⅱ培养基中生长，说明不能合成有机物，只能在Ⅲ培养基中生长，说明属于异养微生物。
故选D。
29．下列有关培养基和菌种鉴定的叙述，错误的是（ ）
A．根据培养基的物理性质可将其分为液体培养基和固体培养基
B．可利用固体培养基上菌落的特征来判断和鉴别细菌的类型
C．利用刚果红培养基上是否形成透明圈来筛选纤维素分解菌
D．在无氮培养基中加入酚红指示剂鉴定尿素分解菌
【答案】D
【分析】
培养基按物理性质分可分固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动；刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素复合物便不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌；分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。
【详解】
A、根据培养基的物理性质可将其分为液体培养基和固体培养基，A正确；
B、每一种细菌在固体培养基上形成固定的菌落特征，这些特征对菌种识别、鉴定有一定意义，B正确；
C、当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌，C正确；
D、在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可用来鉴定尿素分解菌，D错误。
故选D。
二、多选题
30．下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的操作结果。下列叙述中错误的是（ ）
A．甲中涂布前要将涂布器灼烧接着涂菌液
B．甲、乙操作中只有甲可以用于微生物的计数
C．乙中接种环需要灼烧5次
D．乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端
【答案】AC
【分析】
1、平板划线法和稀释涂布平板法都能纯化细菌，但平板划线法不能计数，稀释涂布平板法能使细菌分离成单个，便于计数。
2、关于平板划线法中灼烧接种环的次数，接种前灼烧一次，是为了避免接种环上可能存在的杂菌污染菌种，以后每次接种前灼烧接种环，是为了杀死上次划线结束时接种环上残留的菌种；划线结束时灼烧接种环，是为了及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
【详解】
A、为防止杂菌污染，题图甲中的涂布平板操作 ，涂布前要将涂布器灼烧，冷却8~10 s后才能进行涂布，若灼烧后立即涂布，则会将菌体杀死，A错误；
B、甲是稀释涂布平板法，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，通过统计菌落数，可以推测出菌液中微生物的数量，乙是平板划线法，接种环在划线前后都要灭菌（杀死残留在接种环上的菌种），平板划线法能用于菌种的分离纯化，无法计数，因此只有甲可以用于微生物的计数，B正确；
C、乙是平板划线法中，在每次划线前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环，乙总共划线5次，接种环需要灼烧6次，C错误；
D、乙中连续划线的起点是上一次划线的末端，这样能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个活菌繁殖而来的菌落，D正确。
三、综合题
31．肺炎克雷伯菌是肠杆菌科细菌，常存在于人体上呼吸道和肠道，当机体免疫力降低时，经呼吸道进人肺内而引起相关病症。医学实验室用中国蓝培养基培养克雷伯菌，连续培养24小时和48小时结果分别如图（a）和图（b）所示。
中国蓝培养基的配方（每升）：蛋白胨10.0g 牛肉膏粉3.0g 乳糖10.0g 氯化钠5.0g琼脂13.0g 中国蓝0.05g 玫红酸0.1g，水添加至1L （最终pH7.0±0.2）
（1）本实验使用了_____法接种克雷伯菌，培养基中琼脂的作用是_____，实验室可用_____法长期保存该菌种。
（2）根据培养基的配方可知，培养基一般都含有水、_____、_____和_____四类营养物质，菌落数目统计时，选取菌落数目的范围在_____个的平板进行计数。
（3）此培养基中的中国蓝为指示剂，分解乳糖的细菌在培养基上形成蓝色菌落，不分解乳糖的细菌在培养基上形成淡红色的透明菌落。据此判断，中国蓝培养基属于_____培养基。
（4）在培养克雷伯菌时，将接种的培养基和一个未接种的培养基都放入恒温箱中培养，这样操作的目的是_____。
【答案】平板划线 作为凝固剂 甘油管藏 碳源 氮源 无机盐 30~300 鉴别 检测培养基灭菌是否彻底
【分析】
克雷伯菌属于细菌，可以用培养基直接培养。培养基中一般需要具备水、碳源、氮源、无机盐等营养物质。接种微生物一般有平板划线法、稀释涂布平板法、穿刺接种和斜面接种，根据所培养微生物的特性和实验目的选择合适的接种方式。根据图中培养结果，本实验用了平板划线法，48小时时的菌落数目多于24小时。
【详解】
（1）本实验用了平板划线法接种克雷伯菌，培养基中琼脂的作用是作为凝固剂，使培养基呈现固态，实验室用甘油管藏法长期保存该菌种。
（2）根据培养基的配方可知，培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐四类营养物质，菌落数目统计时，选取菌落数目的范围在30~300的平板进行计数。
（3）中国蓝指示剂对不同菌种所形成的菌落呈现不同颜色，据此判断，中国蓝培养基属于鉴别培养基。
（4）在培养克雷伯菌时，将接种的培养基和一个未接种的培养基都放入恒温箱中培养，这样操作的目的是检查培养基灭菌是否彻底。若空白培养基上长出菌落，说明培养基灭菌不彻底。
【点睛】
本题考查微生物实验室培养的基本内容，要求考生熟记课本内容，并理解应用。
32．开发新能源是解决全球能源危机的有效途径，利用微生物生产油脂是开发新能源的重要方向。科研人员发现某些酵母菌能将碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂在菌体内转化为具有商业价值的脂类。回答下列问题：
（1）为了获得产油酵母菌种，科研人员将土壤样品制成悬浊液，置于以甘油为唯一碳源的液体培养基中进行选择培养，选择培养的目的是_________。甘油进入产油酵母菌体内的主要作用是__________（答出两点）。
（2）准确移取0．1mL选择培养液，采用_________法将其接种于固定培养基上培养2~4d，形成分布均匀的菌落。挑取平板上的单菌落置于载玻片上，加热固定后用苏丹III染液染色，再置于显微镜下观察，若酵母菌细胞内出现__________色的脂肪颗粒，则说明酵母菌细胞中已有脂肪积累。
（3）为获取菌体内的油脂，科研人员将产油酵母菌置于一定浓度的盐酸中，浸泡24h，沸水浴15~20min，此步骤的目的是_________。再将得到的液体冷却后加入氯仿，充分振荡后离心，取氯仿层经过处理得到油脂，采用氯仿萃取脂肪的原理是_________。
【答案】筛选产油酵母菌并增加其浓度 为酵母菌的生命活动提供能量，为合成其他有机物提供原料 涂布平板 橘黄 破碎细胞，释放细胞中的物质 油脂易溶于氯仿
【分析】
筛选目的微生物时应该使用只有目的微生物能够生存，而其他微生物不能生存的选择培养基。选择培养基是指通过培养混合的微生物，仅得到或筛选出所需要的微生物，其他不需要的种类在这种培养基上是不能生存的。
【详解】
（1）以甘油为唯一碳源的液体培养基中进行选择培养，能分解甘油的微生物能大量繁殖，即筛选产油酵母菌并增加其浓度。甘油作为有机碳源，在产油酵母菌体内不仅能氧化分解提供能量，同时为合成其他有机物提供原料。
（2）由题干“形成分布均匀的菌落”可知，接种方法为稀释涂布平板法，苏丹III染液把脂肪染成橘黄色。
（3）产油酵母菌置于一定浓度的盐酸中，浸泡24h，沸水浴15~20min，目的是破碎细胞，释放细胞中的物质。
（4）氯仿是有机溶剂，依据相似相溶原理，脂类易溶于有机溶剂，且与水不互溶。
【点睛】
本题考查筛选目的微生物的原理和方法，掌握无菌技术，微生物的接种方法，把相关知识融合进题中，解决问题。
33．石油田的土壤中可能含有丰富的产油脂芽孢杆菌，该微生物合成的油脂是制备生物柴油的新型原料。回答下列问题：
（1）若要分离土壤中产油脂芽孢杆菌，主要实验步骤：取样→___________→___________→培养→___________。
（2）实验操作前，在密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能___________。实验结束时，培养微生物用的培养基要___________处理，才能倒掉。
（3）选择培养产油脂芽孢杆菌的培养基中加的主要碳源是___________。制备醋酸菌初筛平板时，需要将培养基的pH调至___________性。用平板培养细菌时一般需要将平板___________（填“倒置”或“正置”）。
（4）单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是___________。
【答案】稀释 涂布（或平板划线） 挑选菌落 破坏DNA结构 灭菌 石油 中性或微碱性 倒置 在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
【分析】
消毒和灭菌的辨析
项目
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理、化学或生物等方法
仅杀死物体表面或内部一部分微生物(不包括芽孢和孢子)
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药物消毒法
用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理
化方法
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具
湿热灭菌(如：高压蒸汽灭菌法)
培养基及容器的灭菌
【详解】
（1）油田的土壤中可能含有丰富的产油脂芽孢杆菌，若要分离土壤中产油脂芽孢杆菌，取样后首先应进行稀释，然后通过涂布平板法或平板划线法接种到以石油为唯一碳源的选择培养基中培养，在该培养基上能生长的菌落就是目的菌落，可挑选后进一步培养，故步骤为：取样→稀释→涂布（或平板划线）→培养→挑选菌落。（2）实验操作前，在密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能破坏DNA结构。实验结束时，培养微生物用的培养基要通过灭菌，消灭其中所有微生物，然后才能倒掉，以避免污染环境。
（3）选择培养产油脂芽孢杆菌的培养基中加的主要碳源是石油。醋酸菌属于细菌，培养基的最适pH为为微碱性或中性，制备醋酸菌初筛平板时，需要将培养基的pH调至中性或微碱性。用平板培养细菌时一般需要将平板倒置，以防止冷凝水污染培养基。
（4）在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征，单个细菌在平板上会形成菌落，可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物。
【点睛】
细菌的最适pH为中性或微碱性，霉菌的的最适pH为酸性。
34．科研人员从青藏高原祁连山地区的土壤中分离出一株高效耐低温原油降解菌YF28—1（8），应用该菌能够提高高寒地区石油等烃类污染物的分解效率，为我国的环境保护事业做岀贡献。请回答相关问题
（1）选择青藏高原祁连山地区进行菌种筛选，原因是_______________________________________。
（2）筛选原油降解菌的培养基中应加入_________作为唯一碳源；从功能上看，该培养基属于______培养基。
（3）在实验室中，玻璃和金属器材一般采用________方法进行灭菌。用平板划线法纯化细菌时，第2次划线及其以后划线总是从上次划线的末端开始，目的是___________________________________。
（4）用稀释涂布平板法培养细菌，要定期取样进行菌落计数，一般选择菌落数在____________的平板进行计数。
【答案】该地区的微生物更耐低温（或能找到高效耐低温原油降解菌） 原油（或石油） 选择 干热灭菌 将聚集的微生物逐渐稀释以便获得单个菌落 30～300
【分析】
采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。灭菌常用的方法有化学试剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌等。可根据不同的需求，采用不同的方法，如培养基灭菌一般采用湿热灭菌，空气则采用过滤除菌。
【详解】
（1）选择青藏高原祁连山地区进行菌种筛选，原因是该地区的微生物更耐低温（或能找到高效耐低温原油降解菌）。
（2）筛选原油降解菌的培养基中应加入原油（或石油）作为唯一碳源；从功能上看，该培养基属于选择培养基。
（3）在实验室中，玻璃和金属器材一般采用干热灭菌。用平板划线法纯化细菌时，第2次划线及其以后划线总是从上次划线的末端开始，目的是将聚集的微生物逐渐稀释以便获得单个菌落。
（4）用稀释涂布平板法培养细菌，要定期取样进行菌落计数，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
【点睛】
本题主要考查微生物培养的相关知识，其中准确理解微生物的分离培养方法，是解题的关键。
35．下表是某种微生物培养基的配方表，请据表回答下面的问题：
牛肉膏
蛋白胨
NaCl
琼脂
蒸馏水
0．5g
1 g
0．5 g
1 g
200 mL
（1）此培养基的营养成分有五类，其中蛋白胨提供的营养物质是_________________。
（2）在培养基制备过程中，各种成分溶化后分装前，必须的操作是_________。
（3）在农业生产研究上，常需要进行微生物的培养和计数。如下图是利用______法进行微生物接种，把聚集的菌种逐步分散到培养基的表面。为达到这一目的，操作上应注意：___________________（至少答两项）。
【答案】碳源、氮源、维生素 调节pH 平板划线法 ①每次划线前要灼烧接种环；②冷却后从上一区划线末端开始划；③首尾区不重叠（任选两项）
【分析】
培养基的营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。
【详解】
（1）培养基的营养成分有五类，其中蛋白胨提供的营养物质是碳源、氮源、维生素。
（2）在培养基制备过程中，各种成分溶化后分装前，要调节pH。
（3）图示为平板划线法接种微生物；该接种方法的原理是把聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。为达到这一目的，操作上应注意：每次划线前接种环进行灼烧灭菌，冷却后从上一区划线的末端开始划，以确保下一次划线的菌种来自上一次的末端，首尾区不相连。
【点睛】
本题考查微生物的分离和培养，要求考生识记培养基的营养构成，掌握制备培养基的步骤；识记接种微生物常用的两种方法，尤其是平板划线法的相关操作，能结合所学的知识准确答题。
36．在实验室培养微生物，一方面需要为培养的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。请回答下列相关问题：
（1）培养基能为培养的微生物提供营养。各种培养基的具体配方不同，但一般都含有______、_________、_________、_______；另外，培养基还需要满足微生物对_______、______、______的要求。
（2）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵对实验操作的空间、操作者的衣着和手，需进行清洁和______ （填“消毒”或“灭菌”）；对用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等需进行______ （填“消毒”或“灭菌”）。
（3）微生物接种的方法很多，其核心都是要防止杂菌的污染，保证培养物的纯度。微生物接种最常用的方法______和______。
【答案】水 碳源 氮源 无机盐 pH 特殊营养物质 氧气 消毒 灭菌 平板划线法 稀释涂布法
【分析】
营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
无菌技术（1）关键：防止外来杂菌的入侵；（2）具体操作①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
【详解】
（1）各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
（2）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，对实验操作的空间、操作者的衣着和手，需进行清洁和消毒，对用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等需进行灭菌。
（3）常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布法。
【点睛】
本题主要考查微生物实验室培养的相关知识，意在考查考生对相关知识的理解，把握知识间的内在联系的能力。
37．回答下列与细菌培养相关的问题
（1）在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________（填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”）。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是_______________________。硝化细菌在没有碳源的培养基上_______（填“能够”或“不能”）生长，原因是_________________________。
（2）用平板培养细菌时一般需要将平板________（填“倒置”或“正置”）。
（3）单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是在一定的培养条件下，_________________________________。
（4）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
【答案】蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同 能够 硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源 倒置 不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征 灭菌
【分析】
1、微生物培养基的营养构成：①各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐；②不同培养基还要满足不同微生物对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2、配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的注意事项：①倒平板的温 度一般50℃左右适宜，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固；②平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
【详解】
（1）葡萄糖只能为细菌提供碳源，硝酸钠为细菌提供无机盐，而蛋白胨既可以为细菌碳源，也可以为细菌提供氮源；由于不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同，所以通常在制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH；硝化细菌属于化能自养型微生物，其可以利用氨氧化释放的能量将空气中的二氧化碳固定为有机物，因此硝化细菌可以在无碳培养基中生长。
（2）用平板培养细菌时，一般需要将平板倒置培养，以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
（3）由于每一大类微生物都有其独特的细胞形态，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征，因而其菌落形态特征也各异，因此根据菌落的形态、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物。
（4）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过灭菌处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物，以免污染环境。
【点睛】
解答本题的关键是识记微生物培养基的成分、培育条件、培养过程以及注意事项，能够根据不同微生物的代谢类型判断其所需营养成分的种类，进而结合题干要求分析答题。
根据微生物的分离和培养的知识，回答下列问题：
38．在微生物的实验室培养过程中，获得纯净培养物的关键是__________________。
39．配制培养基时，各种成分在溶化后分装前必须调节_____。
40．实验结束时，使用过的培养基应进行灭菌处理后才能倒掉，这样做的目的是_______。
41．以下材料请选择合适的方法消毒或灭菌：
①培养细菌用的培养基：______________；
②实验操作者的双手：____________；
③实验过程中的接种环：_______________。
42．在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的菌种原液被污染了？为什么？__________，_____________________。
【答案】
38．防止外来杂菌的入侵
39．pH
40．避免杂菌污染环境
41． 高压蒸汽菌 用（70%）的酒精消毒 灼烧灭菌
42． 不能 因为杂菌可能来自培养基或来自培养过程
【分析】
1、无菌技术：泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法,是成功地培养微生物的关键。
2、消毒和灭菌：
（1）消毒：用温和的化学或物理方法，杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢、孢子）的过程。
（2）消毒的方法：①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min；②巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或80 ℃ 下煮15min(低温消毒法)；③化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源；④紫外线消毒：对实验室空气消毒。
（3）灭菌：以强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物（包括芽孢、孢子） ，达到完全无菌的过程。
（4）灭菌的方法：①灼烧灭菌：微生物学实验室的接种环、接种针、试管口等的灭菌②干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。适用于玻璃器皿(如试管、培养皿、吸管、注射器)和金属器具(如针头、镊子、剪刀等)的灭菌。③高压蒸汽灭菌：100kPa、121 ℃下维持15-30min. 最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。④其他灭菌方法：紫外线、超声波、微波、化学药物消毒等。
3、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：
（1）计算根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制100mL的培养基时，各种成分的用量。
（2）称量：准确地称取各种成分。牛肉膏比较黏稠，可以用玻棒挑取，放在称量纸上称量。牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖。
（3）溶化：将称好的牛肉膏连同称量纸一同放人烧杯，加入少量的水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。往烧杯中加人称量好的蛋白胨和氯化钠，用玻棒搅拌，使其溶解。加入琼脂，加热使其熔化。在此过程中，不断用玻棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。当琼脂完全熔化后，补加自来水至100 mL。
（4）灭菌将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压灭菌锅，在 100kPa，温度为121℃条件下灭菌15- 30 min。将培养皿用几层旧报纸包紧，5-8套培养皿作一包，包好后放入干热灭菌箱内，在160-170℃下灭菌2h。
（5）倒平板：待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
38．
在微生物的实验室培养过程中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。
39．
配制培养基时，各种成分在溶化后分装前必须调节pH。
40．
实验结束时，使用过的培养基应进行灭菌处理后才能倒掉，这样做的目的是避免杂菌污染环境。
41．
①培养细菌用的培养基：高压蒸汽菌；
②实验操作者的双手：用（70%）的酒精消毒；
③实验过程中的接种环：灼烧灭菌。
42．
在培养基上还有其他杂菌的菌落，不能肯定该大肠杆菌的菌种原液被污染了，因为杂菌可能来自培养基或来自培养过程。
【点睛】
本题考查微生物的培养和分离，重点考查培养基的制备过程,要求考生识记培养基制备的具体步骤，掌握各步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确判断各选项。
43．为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌的分离等工作。回答下列问题
（1）该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空平板先行培养了一段时间，这样做的目的是_______________________；然后，将1mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0．1mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为_________________。
（2）该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过______灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是___________________________
（3）示意图A和B中，______表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
【答案】检测培养基平板灭菌是否合格 3．8×107 灼烧 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落 B
【分析】
实验室常用的灭菌方法：
（1）灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。此外，在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰燃烧来灭菌；
（2）干热灭菌：能耐高温的，需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌；
（3）高压蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100kPa，温度为121℃的条件下，维持15～30min。
【详解】
（1）该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空平板先行培养了一段时间，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格；然后，将1mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为（39+38+37）÷3÷0.1×100×1000=3.8×107。
（2）该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。
（3）示意图A和B中，图B表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果，图A表示的是用平板划线法接种培养后得到的结果。
【点睛】
本题考查微生物的分离和培养，意在考查学生识记所学知识要点，把握知识间的内在联系，形成知识网络的能力，同时获取题干信息准确答题。
从自然菌样筛选较理想生产菌种的一般步骤是：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。
44．不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养噬盐菌的菌样应从__________环境采集。
45．富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，使其群落中的数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择____________________的培养基，并在__________条件下培养。
46．下面两组图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
获得图A效果的接种方法是__________，获得图B效果的接种方法是__________。
47．配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行__________，接种前要进行____________，在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在______条件下进行。
【答案】
44．海滩等高盐
45． 以淀粉为唯一碳源 高温
46． 稀释涂布平板法 平板划线法
47． pH调整 高压蒸汽灭菌 无菌
【分析】
自然界中目的菌株的筛选的依据是根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找．实验流程为土壤取样→样品的稀释→将稀释液涂布到以尿素为唯一氮源的培养基上→挑选能生长的菌落→鉴定．常用的接种方法主要有平板划线法与稀释涂布平板法。
44．
噬盐菌能适应高盐环境，故噬盐菌的菌样应从海滩等高盐环境采集｡
45．
产耐高温淀粉酶微生物能产生耐高温淀粉酶说明其碳源是淀粉，应选择以淀粉为唯一碳源的培养基，并在高温条件下培养。
46．
图A菌落分布较均匀，接种方法是稀释涂布平板法，图B菌落集中呈线状，接种方法是平板划线法。
47．
配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行调整pH，接种前要进行高压蒸汽灭菌，在实验中要注意在无菌条件下进行。
【点睛】
本题主要考查微生物的筛选与培养，意在强化学生对相关知识的识记、理解与运用。
酸牛奶酒是在牛奶中加入乳酸菌和酵母菌混合发酵而成的一种乳饮料。请回答下列有关问题：
48．牛奶在加入菌种前应进行___________（填消毒或灭菌），酵母菌不具有的结构有___________（填拟核、叶绿体或细胞壁）。
49．已知“改良MC琼脂培养基”中含有碳酸钙，遇酸溶解而使培养基变得透明；“孟加拉红琼脂培养基”含氯霉素，可抑制绝大多数细菌的生长。对乳酸菌进行计数时应选择上述______培养基，用______（填方法）接种，挑选出的菌落进行计数。
50．对乳酸菌、酵母菌双菌混合培养和各自单独培养过程中的活菌数进行定时检测，由结果可知，双菌混合培养时两种菌的最大活菌数均高于其单独培养时，从代谢产物角度分析，其原因可能是______________________________________、除了上述的活菌计数外，_______________ 也是测定微生物数量的常用方法。
【答案】
48． 消毒 拟核、叶绿体
49． 改良MC琼脂培养基 稀释涂布平板法
50． 酵母菌和乳酸菌可以相互利用对方的代谢产物，从而相互促进生长 显微镜直接计数法
【分析】
1、酵母菌属于真核生物，也是兼性厌氧型生物，既能进行有氧呼吸也能进行无氧呼吸。
2、 接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法，其中稀释涂布平板法可对微生物进行计数。
48．
为避免目的菌被杀死，牛奶在加入菌种前应进行消毒处理；酵母菌为真菌 ，无拟核，也无叶绿体。
49．
根据题意可知，“孟加拉红琼脂培养基”含氯霉素，可抑制乳酸菌的生长，因此对乳酸菌进行计数时应选择改良MC琼脂培养基培养基；对微生物计数需要用稀释涂布平板法方法接种，挑选出具有透明圈的菌落进行计数。
50．
结合题意可知，双菌培养时两种菌的最大活菌数均高于其单独培养时，从代谢产物角度分析，其原因可能是酵母菌和乳酸菌可以相互利用对方的代谢产物，从而相互促进生长；除稀释涂布平板法可以计数外，显微镜直接计数法 也是测定微生物数量的常用方法。
【点睛】
本题主要考查微生物分离和培养的相关知识，意在考查考生对所学知识的理解，把握知识间内在联系的能力。
大肠杆菌是寄生于人和动物肠道中的细菌，其代谢产物能与染料伊红美蓝反应，使菌落呈黑色。下面是其培养基配方：
成分
蛋白胨
乳糖
磷酸二氢钾
琼脂
蒸馏水
2%伊红水溶液
0．5%美蓝水溶液
含量
10g
10g
2g
20~30g
1000ml
20ml
13ml
回答下列问题：
51．培养细菌时，培养基PH一般调至__________________。该培养基中，蛋白胨为大肠杆菌提供的主要营养有_____________________和维生素。从功能上分类，该培养基属于____________培养基。
52．对该培养基进行灭菌时，可采用_____________法。在接种大肠杆菌前，需先将灭菌后的空白培养基放在恒温箱中培养一段时间，观察是否有菌落生成，其目的是_______________________________________________________________________。
53．为检测严重污染水体中大肠杆菌数量，将水样适当稀释后，取样涂布在上述平板培养基中，应选择颜色为____________的菌落进行计数。该方法是通过统计平板上的菌落数来推测样品中的活菌数，其原理是____________________________________________。
【答案】
51． 中性或微碱性 碳源、氮源 鉴别
52． 高压蒸汽灭菌 检测培养基制备是否合格（灭菌是否彻底）
53． 黑色 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌
【分析】
1、微生物培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2、鉴别、培养大肠杆菌可使用伊红-美蓝培养基，菌落呈黑色或紫黑色有金属光泽。
51．
微生物培养时需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求，如培养细菌时需将pH调至中性或微碱性；蛋白胨既可以为大肠杆菌提供碳源，也可以为大肠杆菌提供氮源；据表格信息可知，该培养基成分中伊红-美蓝水溶液，故属于鉴别培养基。
52．
对该培养基进行灭菌时，可采用高压蒸汽灭菌法；在接种大肠杆菌前，需先将灭菌后的空白培养基放在恒温箱中培养一段时间，观察是否有菌落生成，其目的是检测培养基制备是否合格（灭菌是否彻底）：若有菌落生成，则证明灭菌不彻底。
53．
大肠杆菌的代谢产物能与染料伊红美蓝反应，使菌落呈黑色，为检测严重污染水体中大肠杆菌数量，将水样适当稀释后，取样涂布在上述平板培养基中，应选择颜色为 黑色的菌落进行计数；通过统计平板上的菌落数来推测样品中的活菌数的原理是当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。
【点睛】
本题考查了微生物分离与培养的有关知识，要求考生能够根据实验原理补充实验步骤，识记培养基的主要成分，并能结合题意分析作答。
下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：
54．甲、乙两种接种方法所用的接种工具分别是_________和_________；对这两种接种工具进行灭菌的方法是_________。
55．平板划线时，为保证微生物的数目随划线次数的增加而逐步减少，每次划线都要从_________开始，平板划线结束后，最后一次划的线不能与第一次划的线_________________。
56．接种操作之所以一定要在火焰附近进行，是因为__________________。
57．下图是接种后培养的效果图解，据此判断接种时采用的是甲、乙两种接种方法中的_______________。
58．假设用图乙所示方法接种培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是_________________________。
【答案】
54． 接种环 涂布器 灼烧
55． 上一次划线末端 相连(或相接、相交、交叉等)
56．火焰附近存在着无菌区域
57．乙
58．稀释倍数不够，菌液的浓度太高
【分析】
1．微生物常见的接种的方法
①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
2．分析题图：图甲的接种方法是平板划线法，图乙的接种方法为稀释涂布平板法。
54．
根据图甲接种后的结果可知，甲接种微生物采用的是平板划线法，这种方法的接种工具是接种环；图乙在培养基中央滴了一滴培养液，可见其利用的是稀释涂布平板，该方法的接种工具是涂布器。对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是灼烧灭菌和酒精消毒。
55．
平板划线法接种时，为保证微生物的数目随划线次数的增加而逐步减少，每次划线都要从上一次划线的末端开始，平板划线结束后，最后一次划的线不能与第一次划的线相交（相接、相连、交叉等）。
56．
由于火焰附近存在着无菌区域，因此为了防止杂菌污染，接种操作一定要在火焰附近进行。
57．
由图可知，菌落均匀的分布在培养皿的培养基上，说明该接种方法为稀释涂布平板法，为方法乙。
58．
假设利用稀释涂布平板法接培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是：①稀释倍数不够，菌液的浓度太高。
【点睛】
本题结合图解，考查微生物的分离和培养，要求考生掌握接种微生物的两种方法及无菌技术，能正确分析题图，再结合所学的知识准确答题。
59．酸牛奶由新鲜牛奶经乳酸菌发酵制成。经乳酸发酵后，牛奶中的乳糖可转化成葡萄糖和半乳糖，进而转变为乳酸等小分子化合物，易于消化。乳酸菌还能改变肠道环境，抑制有害菌繁殖，调整胃肠道菌群的平衡。低温酸奶一般在2-6℃可储藏21天，在室温下乳酸杆菌加快繁殖，会因过度生长发酵而提前死亡，并造成酸奶营养损失和酸度增加。保加利亚乳酸杆菌为酸奶发酵的常用菌种，最适生长温度为42-45℃。某研究小组欲验证室温长期保存会导致保加利亚乳酸杆菌死亡，从而造成酸奶品质下降。请完善下列实验方案。
（1）制备培养基：筛选保加利亚乳酸杆菌需使用_________培养基，其成分除了水、碳源、氮源和无机盐外，还应加入_______作为凝固剂。
（2）灭菌：对培养基进行灭菌的方法是_________，如需调节培养基的pH应在灭菌_______（前/后）进行。
（3）接种培养：将2-6℃和室温保存10天的酸奶分别用缓冲液稀释104、105、106倍，再使用______________法将稀释液接种到灭菌后的培养基上，放入_______（有氧/无氧）环境、42℃恒温箱中培养48小时，以利于其长出稳定菌落。此过程还需要设置________平板作为对照，目的是__________________。统计平板上呈现不规则圆形的灰白色菌落数。
（4）预期结果：________________________。
【答案】选择 琼脂 湿热灭菌（高压蒸汽灭菌） 前 稀释涂布平板 无氧 未接种酸奶稀释液的空白 排除培养基被杂菌污染 室温保存的酸奶实验组不规则圆形灰白色菌落的平均数少于2-6℃低温保存的对照组
【分析】
（1）培养基的营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。培养基的分类：①按物理性质分，分为液体培养基和固体培养基，固体培养基中含有凝固剂，一般是琼脂。②按化学成分分，分为天然培养基和合成培养。两者的区别是天然培养基成分不确定，合成培养基成分的含量是确定的。③按用途分，分为选择培养基和鉴别培养基。选择培养基主要是培养、分离特定的微生物，培养酵母菌可在培养基中加入青霉素；鉴别培养基可以鉴定不同的微生物，比如鉴别饮用水中是否含有大肠杆菌，可以用伊红-美蓝培养基，如果菌落呈深紫色，并带有金属光泽，说明有大肠杆菌。
（2）常用灭菌方法：灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌法。培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌和消毒方法依次：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌、化学消毒、紫外线灭菌、巴氏消毒法。
（3）接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。接种的目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在培养基表面形成单个细菌繁殖而成的子细胞群体--菌落。
【详解】
（1）筛选保加利亚乳酸杆菌需使用选择培养基，其成分除了水、碳源、氮源和无机盐外，还应加入琼脂作为凝固剂。
（2）采用湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）对培养基进行灭菌，如需调节培养基的pH应在灭菌前进行。
（3）将2-6℃和室温保存10天的酸奶分别用缓冲液稀释104、105、106倍，再使用稀释涂布平板法将稀释液接种到灭菌后的培养基上，乳酸杆菌进出无氧呼吸，产生乳酸，所以在培养放入无氧环境、42℃恒温箱中培养48小时，以利于其长出稳定菌落。此过程还需要设置未接种酸奶稀释液的空白平板作为对照，目的是排除培养基被杂菌污染。统计平板上呈现不规则圆形的灰白色菌落数。
（4）实验的目的是验证室温长期保存会导致保加利亚乳酸杆菌死亡，从而造成酸奶品质下降。实验培养设置的了常温培养和2-6℃培养，预期结果：室温保存的酸奶实验组不规则圆形灰白色菌落的平均数少于2-6℃低温保存的对照组。
【点睛】
本题的知识点是微生物培养过程，接种微生物的常用的接种方法，主要考生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。
60．经人工诱变后，部分细菌由于某种酶被破坏，其细胞中某些化学反应不能正常进行，就形成了营养缺陷型菌株，这在工业生产上有较广阔的应用前景。以下是实验人员利用影印法初检某种氨基酸缺陷型菌株的过程，请回答下列问题：
（1）微生物生长需要的营养物质有水、碳源和_______________等，除此之外，制备如图所示的培养基还需要加入__________________。
（2）培养基的灭菌方法一般为_______________。过程①的接种方法是__________________。
（3）根据用途分类，图中基本培养基属于________（填“选择”或“鉴别”）培养基。
（4）科研人员用放射线处理目的菌获得两个突变株C和D，然后对突变株C和D进行实验，结果如表所示。
接种的菌种
一般培养基
实验处理及结果
C
不生长
添加营养物质甲，能生长
D
不生长
添加营养物质乙，能生长
C＋D
能生长
不添加营养物质甲、乙，都能生长
突变株C不能在一般培养基上生长的原因最可能是___________________________。将突变株C和D混合在一起，接种于一般培养基上，都能生长的最可能的原因是________________________________________________________________________。
【答案】氮源、无机盐 凝固剂（或琼脂） 高压蒸汽灭菌法 稀释涂布平板法 选择 自身不能合成物质甲 突变株C 能合成物质乙，突变株D能合成物质甲，因此一起培养可以相互支持保证必须的营养要素
【分析】
分析题图，图中首先利用稀释涂布平板法分离细菌，然后运用“影印法”将菌种接种到两种培养基中：基本培养基、完全培养基，则在基本培养基中，氨基酸缺陷型菌株不能生长，而在完全培养基中能够生长，因此可以选择出氨基酸缺陷型菌株。
【详解】
（1）微生物的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，图示培养基上最后都长出了菌落，说明为固体培养基，因此制备培养基时需要加入凝固剂，常见的凝固剂是琼脂。
（2）培养基的灭菌的常用方法是高压蒸汽灭菌法。过程①导致菌落均匀分布，因此该方法为稀释涂布平板法。
（3）图示过程最终筛选出了氨基酸缺陷型菌株，说明图中基本培养基属于选择培养基.
（4）突变株C不能在一般培养基上生长的直接原因是自身不能合成物质甲．将突变株C和D混合在一起接种于一般培养基中，却能正常生长的最可能原因是突变株C能合成物质乙，突变株D能合成物质甲，因此一起培养可以相互支持保证必须的营养要素。
【点睛】
本题以图文结合的形式综合考查学生对微生物的实验室培养、微生物的分离与计数等相关知识的识记和理解能力。解答本题需熟记并理解相应的基础知识并形成清晰的知识网络。在此基础上，结合问题情境，从题图中提取有效信息进行相关问题的解答。
61．酸奶和泡菜的制作都离不开乳酸菌，某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料纯化乳酸菌。分离纯化所用的固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙从而产生溶钙圈。据此回答下列问题：
（1）下列生物的代谢类型和乳酸菌相同的是____（酵母菌，醋酸杆菌，破伤风杆菌，蓝藻），题目中分离纯化乳酸菌所用的培养基从功能角度判断属于__________培养基，分离纯化时应挑选出有______________的菌落作为候选菌。
（2）下图是用不同方法分离纯化乳酸菌得到的结果，A和B所用的接种方法分别是___________________和__________，两种方法都有将聚集的微生物进行稀释的操作，目的是_________________。如果要统计泡菜汁中乳酸菌的数目，应选择方法______________（A，B，A和B均可）。
（3）如果要对分离得到的乳酸菌进行保藏，对于频繁使用的菌种采用______________法，对于要长期保存的菌种采用 ________________法
【答案】破伤风杆菌 鉴别 溶钙圈 平板划线法 稀释涂布平板法 培养基表面形成由单个细胞繁殖而来菌落 B 临时保藏法 甘油管藏法
【分析】
1、酸奶和泡菜的制作原理：在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。2、接种微生物常用的两种方法：①平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。②稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
【详解】
（1）酵母菌是兼性厌氧型、醋酸杆菌是异养需氧型、破伤风杆菌是异养厌氧型、蓝藻是自养需氧型，乳酸菌是异养厌氧型。故代谢类型和乳酸菌相同的是破伤风杆菌。题目中分离纯化乳酸菌所用的培养基从功能角度判断属于鉴别培养基。分离纯化所用的固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙从而产生溶钙圈。故分离纯化时应挑选出有溶钙圈的菌落作为候选菌。
（2）据图可知，A所用的接种方法是平板划线法，B所用的接种方法是稀释涂布平板法，两种方法都有将聚集的微生物进行稀释的操作，目的是在培养基表面形成由单个细胞繁殖而来菌落。可用方法B来统计泡菜汁中乳酸菌的数目。
（3）如果要对分离得到的乳酸菌进行保藏，对于频繁使用的菌种采用临时保藏法，用试管固体斜面培养基培养乳酸菌，在4℃冰箱保藏；对于要长期保存的菌种采用 甘油管藏法，在-20℃冷冻箱中保存。
【点睛】
本题考查微生物的分离和培养及菌种的保藏，对于此类试题，需要考生注意的细节较多，如实验的原理、实验采用的方法、实验步骤等，需要考生在平时的学习过程中注意积累。
62．定水样是否符合饮用水卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌的数目。滤膜法的大致流程如图所示：用滤膜过滤待测水样→水样中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到EMB培养基上培养→统计菌落数目。请据图回答问题：
注：EMB培养基的成分：蛋白胨、NaCl、乳糖、水、X和琼脂
（1）EMB培养基中为细菌提供碳源的是___________，添加的X是__________，大肠杆菌在含有X的培养基表面长出的菌落呈黑色，从功能上看，EMB培养基属于________培养基。
（2）待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上的操作为：在无菌条件下，用___________冲洗滤杯，并再次过滤水样。
（3）取10mL待测水样加入90mL无菌水稀释，稀释后取10mL菌液通过滤膜法测得三个平板上的黑色菌落数分别为13、15、17，推测1L待测水样中的大肠杆菌数目为________个。
（4）在培养过程中，发现空白对照组的平板上检测到少许菌落，请分析最可能的原因是______________。
（5）如果在实验组的培养基上添加了青霉素再进行相同的操作，预测检测的大肠杆菌菌落数_______（填“会”或“不会”）变化，原因是______________。
【答案】蛋白胨和乳糖 伊红美蓝 鉴别 无菌水 1500 培养基灭菌不合格（不彻底）或培养过程被杂菌污染 会 青霉素会抑制细菌的生长
【分析】
滤膜法是检测水样中大肠杆菌群的方法。将一定量水样注入已灭菌的微孔薄膜的滤器中，经过抽滤，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴于伊红美蓝培养基（EMB培养基）上，经培养后计数和鉴定滤膜上生长的大肠杆菌菌落，依据过滤水样体积计算每升或每100毫升水样中的大肠杆菌菌群数。该方法操作简单、快速，主要适用于杂质较少的水样。
【详解】
（1）通过EMB培养基（伊红美蓝琼脂培养基）配方可知，EMB培养基中为细菌提供碳源的是蛋白胨和乳糖，添加的X是伊红美蓝，从功能上看，EMB培养基属于鉴别培养基。
（2）待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，可在无菌条件下，用无菌水冲洗滤杯，再次过滤，将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上，使实验测定结果更准确。
（3）无菌操作下将10ml 待测水样加入到90ml无菌水中，即稀释了10倍，稀释后的1mL菌液通过滤膜法测得EMB培养基上的菌落数平均为（13+15+17）÷3÷10=1.5个，黑色菌落为大肠杆菌，则推测1升待测水样中的大肠杆菌数目为1.5×1000=1500个。
（4）在培养过程中，发现空白对照组的平板上检测到少许菌落，可能是培养基灭菌不合格（不彻底）或培养过程被杂菌污染。
（5）如果在实验组的培养基上添加了青霉素再进行相同的操作，预测检测的大肠杆菌菌落数会变化，原因是青霉素会抑制细菌的生长。
【点睛】
本题以实验流程图为载体，考查了微生物的分离与计数的有关知识，要求考生能根据图示明确滤膜法的原理和步骤，掌握大肠杆菌的鉴定、分离与计数方法，结合题干信息准确答题。
63．苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据下图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：
（1）酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有_____。
（2）将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐_____，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步_____，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加_____。
（3）下图为连续划线法示意图，在图中_____（填图中序号）区域更易获得单菌落。在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上次划线的末端开始划线？_________。
（4）采用比色测定法（使用苯酚显色剂）检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5 号比色管的苯酚浓度应依次为_____。
管号
1
2
3
4
5
6
苯酚浓度/（mg·L-1）
1
如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21% 的苯酚残留，则需将残留液稀释_____（填序号：①5 ②10 ③20）倍后，再进行比色。
【答案】蛋白胨、苯酚 增加 稀释或稀释涂布 凝固剂或琼脂 ③ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少。每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而成的菌落。 0、0.2、0.4、0.6、0.8 ③
【分析】
稀释涂布平板法和平板划线法接种目的菌进行分离、纯化，前者主要应用于对目的菌进行计数，通过形成菌落来估算，后者仅仅是纯化菌种，但也需要挑选单菌落，所以二者都需要在固体培养基上完成培养。为了防止操作中、操作后造成杂菌污染，所以应注意每个环节中尽可能做到无菌操作，如对接种环的灼烧，在酒精灯的火焰旁进行接种环操作等等。
【详解】
（1）从培养基的成分来看，只有蛋白胨和苯酚内含有碳元素，其中可作为碳源的有蛋白胨、苯酚。
（2）因为最终要获得的菌株为可以高效降解酚的菌株，所以苯酚的用量应随转接次数增加而逐渐增加；稀释涂布平板法可以分离密集菌落，同时便于菌落的分离和计数，因此若上图平板中菌落过于密集，应进一步稀释或稀释涂布，以便于菌落计数与分离；平板培养基为固体培养基，在制备时除应加入的水及其他营养物质后，还需加入凝固剂（琼脂）。
（3）图示为平板划线法得到的平板，依据是每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，最后一次划线结束时更容易获得单菌落，因此图中③区域更易获得单菌落。平板划线法操作在作第二次以及其后的划线操作时，划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少。每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而成的菌落。
（4）题干中提到要制作系列浓度梯度进行显色反应，共配制了六支比色管，所以六支比色管的浓度值依次分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1；废水中含有50mg/L 苯酚溶液，降解后剩余21%，则剩余中含有50×21%=10.5mg/L 苯酚溶液，经过5倍或10倍稀释后分别为2.1mg/L 和1.05mg/L ，不在比色区间内，而20倍稀释后浓度为0.5mg/L ，在比色区间内，因此要稀释20倍后再进行比色。
故选③。
【点睛】
本题涉及用稀释涂布平板法和平板划线法接种目的菌进行分离、纯化和计数，关键是需要明确它们的操作方法和要求。如为什么需要对菌液进行稀释，为什么需要对接种环进行灼烧，为什么要用固体培养基等等。
营养缺陷型菌株就是在人工诱导（或自发突变）下，微生物细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏掉，使代谢过程中的某些合成反应不能进行，从而为工业生产积累大量的原料产物。以下是实验人员利用影印法初检氨基酸缺陷型菌株的过程，请回答。
64．过程①的方法为 _________________ ，与基本培养基（只含碳源、无机盐、水）相比，待测培养皿中特有的成分有______________________。
65．过程②应将印在丝绒布上的菌落先转印至____________培养基上，原因是___________________________________________________________________。 釆用影印法培养的优点是________________________________________ 。
66．为进一步完成对初检的缺陷型菌株的鉴定，实验人员进行了如下操作：
①用接种针挑取_____________（选填“菌落A”或“菌落B”）菌落接种于盛有完全培养液的离心管中，28℃震荡培养1—2天后，离心，取沉淀用 _____________洗涤菌体3次并制备成菌悬液。②吸取1mL菌悬液加入无菌培养皿中，倾注约15mL融化并冷却至45—50℃的基本琼脂培养基，冷凝后用记号笔在培养皿的皿底划分五个区域，做好标记。
③在划分的五个区域上放入少量分组的氨基酸结晶或粉末（五组混合氨基酸如下表所示），经培养后，观察生长圈出现的区域，从而确定属于何种氨基酸缺陷型。
组别
所含氨基酸
A
组氨酸
苏氨酸
谷氨酸
天冬酰胺
亮氨酸
B
精氨酸
苏氨酸
赖氨酸
甲硫氨酸
苯丙氨酸
C
酪氨酸
谷氨酸
赖氨酸
色氨酸
丙氨酸
D
甘氨酸
天冬氨酸
甲硫氨酸
组氨酸
丝氨酸
E
胱氨酸
亮氨酸
苯丙氨酸
丙氨酸
丝氨酸
在上述鉴定实验中，发现在培养基的A、D区域出现生长圈，则说明该缺陷型属于_________。
【答案】
64． 稀释涂布平板法 氨基酸
65． 基本 防止基本培养基中混入特殊的（氨基酸）营养成分 保证不同培养皿同种菌株的接种位置相同
66． 菌落A 无菌水 组氨酸缺陷型
【分析】
分析图可知：图中首先利用稀释涂布平板法分离细菌，然后运用“影印法”将菌种接种到两种培养基中：基本培养基、完全培养基，在基本培养基中，氨基酸缺陷型菌株不能生长，而在完全培养基中能够生长，因此可以选择出氨基酸缺陷型菌株。
64．
分析图解可知，过程①导致菌落均匀分布，因此该方法为稀释涂布平板法。两种培养基分别培养是为了筛选出氨基酸缺陷型菌株，因此与基本培养基（只含碳源、无机盐、水）相比，待测培养皿中特有的成分有氨基酸，类似于完全培养基。
65．
过程②应将印在丝绒布上的菌落先转印至基本培养基上，原因是防止基本培养基中混入特殊的（氨基酸）营养成分。采用影印法培养的优点是保证不同培养皿同种菌株的接种位置相同。
66．
①比较基本培养基（缺乏氨基酸）和完全培养基（含有氨基酸）中的菌落可知，菌落A为氨基酸缺陷型菌株（菌落更多），因此需要用接种针挑取菌落A接种于盛有完全培养液的离心管中，28°C震荡培养 1-2天后，离心，取沉淀用(无菌) 生理盐水洗涤菌体3次并制备成菌悬液。
③在划分的五个区域上放入少量分组的氨基酸结晶或粉末（五组混合氨基酸如下表所示），经培养后，观察生长圈出现的区域，根据题意可知，在培养基的A、D区域出现生长圈，说明A和D两种培养基中存在缺陷的氨基酸（因为加入了氨基酸，缺陷型菌株会生长，从而出现生长圈），与BCD组比较可知，AD组中的组氨酸是特有且相同的氨基酸，因此说明该缺陷型属于组氨酸缺陷型。
【点睛】
本题考查了微生物的分离与培养的有关知识，要求考生能够根据题干信息确定该菌种的筛选过程，同时能够根据表格信息确实能够缺陷的氨基酸种类，意在考查考生的信息处理能力。
67．苹果干腐病是由某种真菌感染引起的疾病，某植保人员设计实验研究了药物苦参碱和福美砷的抑菌效果。实验结果如下表所示，回答下列相关问题：
材料：经0．1%氯化汞消毒的9cm感染组织块
组别
无菌水
0．5%苦参碱
（植物源杀虫剂）
40%福美砷药液
（化学农药）
抑菌率（%）
PDA培养基培养配方：马铃薯、葡萄糖、链霉素、琼脂、蒸馏水
A
＋
－
－
0
B
－
＋
－
84.0
C
－
－
＋
82.6
注：＋表示加入，－表示不加。
（1）设置A组的作用是_________，PDA培养基是________（填物理状态）培养基，需采用_______法灭菌，推测PDA培养基中添加链霉素的目的是____________________________。
（2）本实验观测指标是：__________________________。
（3）根据实验结果，植保人员建议使用0．5%苦参碱防治苹果干腐病，建议的依据是①_________________；②_____________________。
【答案】对照 固体 高压蒸汽灭菌 抑制细菌生长，不影响真菌生长 培养基上的菌落数 0．5%苦参碱的抑菌效果与40%福美砷相当 苦参碱是植物源杀虫剂无残留不会污染环境，而福美砷是化学农药，长期使用会污染环境、影响人体健康
【分析】
培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；分为固体培养基和液体培养基，培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐，其中碳源和氮源常采用蛋白胨和牛肉膏，因为它们来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物种和氧气的要求。
【详解】
（1）本实验是研究药物苦参碱和福美砷的抑菌效果，A组没有加入药物苦参碱和福美砷，而是加入了等量的无菌水、目的是作为对照组。PDA培养基成分中含有琼脂，所以是固体培养基。培养基灭菌应用高压蒸汽灭菌。PDA培养基中添加链霉素的目的抑制细菌生长，但不影响真菌生长，可排除细菌对该实验的影响。
（2）该实验是研究药物苦参碱和福美砷的抑菌效果，若菌体生长被抑制，则培养基上的菌落数减少，所以本实验的观测指标是培养基上的菌落数。
（3）通过上述实验，植保人员建议使用0.5%苦参碱防治苹果干腐病。这是因为0.5%苦参碱的抑菌效果比40%福美砷略好，并且苦参碱是植物源杀虫剂、无残留、不会污染环境，而福美砷是化学农药，长期使用会污染环境、影响人体健康。
【点睛】
本题考查微生物的分离和培养，以苹果干腐病的防治为背景，考查了培养基的类型和无菌技术等知识，要求考生能够分析实验结构得出正确的实验结论。
68．酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。如图所示为操作流程，请回答下列问题：
（1）配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的___________，及时对培养基进行分装，并进行___________灭菌。
（2）取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约_________（在25℃，50℃或80℃中选择）的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后__________培养。
（3）挑取分离平板中长岀的单菌落，按步骤④所示进行划线。划线应注意的事项有__________________（答出两项即可）；步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和_________供应。
（4）研究人员从土壤样品中获得该类酵母后，若需要长期保存，可以采用______________的方法。
【答案】pH 高压蒸汽 50℃ 倒置 为保证无菌操作，接种环使用前都必须灭菌；每次划线结束后要进行灼烧；每一次在上一次划线结束处开始；划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落等 氧气 甘油管藏
【分析】
据图分析，①称量土样，里面含有需要分离的酵母菌；②表示梯度稀释，③④表示平板划线法，进行纯化培养；⑤表示扩大培养，获得更多的酵母菌。
【详解】
（1）配制培养基的操作步骤为称量→溶化→定容→调pH→分装→包扎→灭菌→倒平板，因此微生物的培养基配制好后应先调 pH，再分装。常见的灭菌方法有：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌。培养基适宜用高压蒸汽灭菌法灭菌。
（2）倒平板时需待培养基冷却到50℃左右时倒平板，冷凝后倒置培养，防止冷凝形成的水珠落入培养基后污染培养基。
（3）在划线过程中，接种针、接种环使用前必须灭菌，以防止杂菌污染培养基；每次划线结束后要进行灼烧，以清除接种环上残留菌种；每一次在上一次划线结束处开始，为了保证接种环上的酵母菌来自于上一次划线末端，通过增加划线次数使每一次划线时的酵母菌数目逐渐减少，最终得到由单个细胞繁殖而来的菌落；划线时应避免划破培养基表面，大量酵母菌聚集，不能形成正常菌落。酵母菌的代谢类型是兼性厌氧型，有氧呼吸可以产生大量能量供酵母菌大量繁殖，所以需提供足够的氧使酵母数量迅速增加。
（4）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
【点睛】
本题主要考查对食用菌菌种扩大培养并保存的过程中涉及的培养基配制、灭菌及菌种转移和保藏的一些基础知识，考生需注意归纳总结，才能减少犯错。
高考一轮生物复习策略
1、落实考点。
一轮复习时要在熟读课本、系统掌握基础知识、基本概念和基本原理后，要找出重点和疑点；通过结合复习资料，筛选出难点和考点，有针对地重点复习。这就需要在掌握重点知识的同时，要善于进行知识迁移和运用，提高分析归纳的能力。
2、注重理论联系实际，高三生物的考试并不仅仅是考概念，学会知识的迁移非常重要，并要灵活运用课本上的知识。
不过特别强调了从图表、图形提取信息的能力。历年高考试题，图表题都占有比较大的比例。那些图表题虽不是教材中的原图，但它源于教材而又高于教材，是对教材内容和图表的变换、深化、拓展，使之成了考查学生读图能力、综合分析能力、图文转换能力的有效途径。
3、一轮复习基础知识的同时，还要重点“攻坚”，突出对重点和难点知识的理解和掌握。
这部分知识通常都是学生难于理解的内容，做题时容易出错的地方。分析近几年的高考生物试题，重点其实就是可拉开距离的重要知识点。
4、学而不思则罔，思而不学则殆。
这一点对高三生物一轮复习很重要。尤其是对于错题。错题整理不是把错题抄一遍。也不是所有的错题都需要整理。
专题53 微生物的实验室培养
1．培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。
(3)种类
①按照物理性质可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。
②按照成分的来源可分为天然培养基和合成培养基。
③按照功能用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。
2．无菌技术
(1)含义：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
(2)常用方法
3．大肠杆菌的纯化培养
(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
→→→→
(2)纯化大肠杆菌的方法
①平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
特别提醒 a．操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：
第一次操作
每次划线之前
划线结束
目的
杀死接种环上原有的微生物
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
b.灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
c．第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
d．划线时最后一区不要与第一区相连。
e．划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
②稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
(3)菌种的保存方法
①对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
②对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
解题技巧
1．培养基的配制原则
(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
(3)pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需的pH不同。
2．微生物对主要营养物质的需求特点
(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。
(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。
两种纯化细菌方法的比较
项目
优点
缺点
适用范围
平板划线法
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
不能计数
适用于
好氧菌
稀释涂布平板法
可以计数，可以观察菌落特征
吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
一、单选题
1．下列无菌操作错误的是（ ）
A．取出已经过灭菌的物品时，容器盖勿全开，能方便取出即可
B．取出已经过灭菌的物品，如未使用，应立即放回
C．疑有污染或己被污染时，应更换或重新灭菌
D．手持无菌容器时应托住底部，手只能触及容器边缘
【答案】B
【分析】
在微生物的实验室培养中获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下几个方面：
1、对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；
2、将用于微生物培养的培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；
3、为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；
4、实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。
【详解】
A、周围物品可能会含有杂菌，为防止杂菌污染，无菌技术操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品的接触，取出已经过灭菌的物品时，容器盖勿全开，能方便取出即可，A正确；
B、取出已经过灭菌的物品，如未使用，不应立即放回，会污染其他物品，B错误；
C、疑有污染或己被污染时，应更换或重新灭菌，达到无菌的要求，C正确；
D、手持无菌容器时应托住底部，手只能触及容器边缘，防止污染无菌容器，D正确。
故选B。
2．氢气是一种清洁能源，可由产氢菌群无氧发酵产生。科研人员从厌氧活性污泥中获得产氢菌群，在分离、纯化产氢菌群的操作中，为防止杂菌污染，对培养皿、接种环、涂布器，培养基等都可采用下列哪种方法处理? （ ）
A．巴氏消毒法 B．灼烧灾菌
C．干热灭菌 D．高压蒸汽灭菌
【答案】D
【分析】
实验室常用的灭菌方法：
1、灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌，此外，在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰燃烧来灭菌。
2、干热灭菌：能耐高温的，需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌。
3、高压蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121℃的条件下，维持15～30 min。
【详解】
培养基不能通过灼烧灭菌和干热灭菌的方法进行灭菌，玻璃器皿（吸管、培养皿）一般不用灼烧灭菌的方法灭菌，而巴氏消毒法是指在75℃煮30min或80℃煮15min进行杀菌，属于消毒；故在分离、纯化产氢菌群的操作中，为防止杂菌污染，对培养皿、接种环、涂布器，培养基等都可采用高压蒸汽灭菌方法处理，即D符合题意。
故选D。
3．高温灭菌的原理是（ ）
A．微生物对高温环境不适应
B．高温降低了环境中氧的浓度
C．每种微生物生长的最适温度是一定的
D．高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动
【答案】D
【分析】
高压蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121℃的条件下，维持15～30 min。
【详解】
蛋白质和核酸是细胞表现生命活动的最重要物质，它们都是高分子化合物，具有复杂的空间结构，高温能使他们的空间结构受到破坏而失去活性，所以高温灭菌的原理是高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动，故选D。
4．下列操作不需要在酒精灯火焰旁进行的是（ ）
A．土壤取样 B．平板划线
C．稀释土壤溶液 D．涂布平板
【答案】A
【分析】
无菌技术的主要内容：①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
【详解】
酒精灯火焰附近存在一个无菌区，平板划线、稀释土壤溶液、涂布平板操作都需要在酒精灯火焰附近进行，以免杂菌污染；土壤是微生物的土壤培养基，土壤取样时不需要在酒精灯旁操作，A符合题意。
故选A。
5．牛奶消毒及细菌检测实验的过程如下图所示，下列相关叙述正确的是（ ）
A．步骤①为巴氏消毒法，这种方法可以杀死所有的微生物以及芽孢和孢子
B．实验中试管、培养基可采用热灭菌
C．实验中采用稀释涂布平板法计数，可能导致实验结果偏高
D．稀释涂布平板法操作中涂布器需经灼烧灭菌冷却后再涂布
【答案】D
【分析】
巴氏消毒法：采用较低温度(一般在60～82℃)，在规定的时间内，对食品进行加热处理，达到杀死微生物营养体的目的，是一种既能达到消毒目的又不损害食品品质的方法。获取纯净培养物的关键是防止外来杂菌污染。
【详解】
A、①为巴氏消毒法，不能杀死所有芽孢和孢子，A错误；
B、实验中试管用干热灭菌，培养基用高压蒸汽灭菌，B错误；
C、采用稀释涂布平板法计数，可能导致实验结果偏低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，C错误；
D、稀释涂布平板法操作中涂布器需经灼烧灭菌冷却后再涂布，防止烧伤菌种，D正确。
故选D。
6．在三个培养皿中各加入等量但不同种的大肠杆菌培养基，在培养皿中培养 36 小时后，统计大 肠杆菌的菌落数（如表）。下列表述错误的是（ ）
培养皿
培养基成分
菌落数/个
Ⅰ
琼脂、糖类
35
Ⅱ
琼脂、糖类和维生素
250
Ⅲ
琼脂和维生素
0
A．本实验使用的是固体培养基
B．对照培养皿Ⅰ和Ⅱ，说明维生素是大肠杆菌需要的生长因子
C．对照培养皿Ⅱ和Ⅲ，说明糖类是大肠杆菌需要的碳源
D．对照培养皿Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，说明琼脂是培养基中必需的营养成分
【答案】D
【分析】
1、培养基的基本成分：水、无机盐、碳源、氮源。
2、实验设计的原则有单一变量原则和对照原则。该实验设置的自变量是培养基中糖类和维生素的有无，因变量是培养基中的菌落数。为了确保实验结果只是由自变量的不同引起的，应当使对照实验中的实验组和对照组所处的温度等环境条件都相同。
【详解】
A、本实验添加了琼脂，使用的是固体培养基，A正确；
B、培养皿Ⅰ和Ⅱ的区别在于是否添加维生素，结果I中菌落数少于II中，说明维生素是大肠杆菌需要的生长因子，B正确；
C、培养皿Ⅱ和Ⅲ的区别在于是否添加糖类，结果II中的菌落数多而III中无菌落，说明糖类是大肠杆菌需要的碳源，C正确；
D、培养基的基本成分：水、无机盐、碳源、氮源，琼脂是凝固剂，不是营养成分，D错误。
故选D。
7．漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是（ ）
A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品
B．选择培养基中需要加入漆酶的底物作为唯一碳源
C．在已涂布的平板上直接划线可以进一步纯化获得单菌落
D．斜面培养基中含有大量营养物质，可在常温下长期保存菌株
【答案】B
【分析】
稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。
用途：一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养基的回收率计数。
优点：可以计数，可以观察菌落特征。
缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的话，长不出单菌落。
【详解】
A.生活污水中含有大量微生物，而漆酶属于木质降解酶类，因此污水中不一定含有产漆酶的菌株，A错误；
B.选择培养基中需要加入漆酶的底物作为唯一碳源，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落，从而获得漆酶菌株，B正确；
C.划线前需要将接种环进行灭菌，且利用平板划线法需要连续划线，才能逐渐分离得到单菌落，C错误；
D.短期保存可利用试管斜面培养基，在0-4℃冰箱中保存，长期保存菌株是在-20℃用甘油管藏，D错误。
故选：B。
8．如图是实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤。下列说法错误的是（ ）
A．①步骤使用的培养基已经高温高压蒸汽灭菌且冷却至50℃左右
B．②过程挑取菌种前后试管口均需通过火焰
C．③所示的接种方法不能用来进行细菌计数
D．④操作过程中，需灼烧接种环5次
【答案】D
【分析】
如图是实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，①是倒平板，②是用接种环沾取菌液，③是进行平板划线，④是培养。
【详解】
A、①步骤表示倒平板，使用的培养基已经高温高压蒸汽灭菌且冷却至50℃左右，A正确；
B、②过程挑取菌种前后试管口均需通过火焰，防止被杂菌污染，B正确；
C、③是进行平板划线，平板划线法开始得到的菌体是连在一起生长的，故该方法不能用于计数活菌，只能用于分离菌种，C正确；
D、接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以完成步骤④中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，完成步骤④共需灼烧接种环6次，D错误。
故选D。
9．生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需生长因子的种类，某研究小组把该菌的悬浮液与不含任何生长因子但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒成平板，然后在平板上划分数区，将甲、乙、丙三种生长因子分别添加到不同区域，培养结果如图所示，下列说法正确的是（ ）
A．本实验不需要另外设置对照实验
B．图示结果表明该菌需要生长因子乙或丙
C．平板中添加完生长因子，待冷凝后需倒置培养
D．实验结束后，使用过的培养基必需消毒后倒掉
【答案】C
【分析】
把某嗜热菌的悬浮液与不含任何生长因子但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒成平板，然后在平板上划分数区，将甲、乙、丙三种生长因子分别添加到不同区域，据图可知，只在乙和丙交接处有微生物生长。
【详解】
A、本实验需要设置空白对照，判断培养基配制是否合理，及没有生长因子时的生长状况，A错误；
B、由于只在乙和丙交接处有微生物生长，可判断该菌生长需要的生长因子是乙和丙，B错误；
C、为了防止形成的冷凝水滴落在培养基上造成杂菌污染和培养基的水分过快蒸发，平板要倒置培养，C正确；
D、实验结束后，使用过的培养基应该灭菌后再倒掉，消毒不一定能完全杀死孢子和芽孢，D错误。
故选C。
10．下列有关倒平板的操作，正确的是（ ）
A．培养基冷却到常温再进行倒平板
B．培养皿打开后培养皿盖倒放在桌面上
C．整个倒平板操作过程无需在酒精灯火焰旁进行
D．待平板冷却凝固后需要倒过来放置
【答案】D
【分析】
倒平板操作的步骤：将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞；右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰；用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖；等待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置，使皿盖在下、皿底在上，这样可以防止皿盖上的水分滴到培养基上造成培养基的污染。
【详解】
A、已灭菌的培养基冷却到大约50℃时可倒平板，A错误；
B、应将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌子上，这样可能会造成杂菌污染，B错误；
C、倒平板过程需要在酒精灯火焰旁进行，防止空气中的杂菌污染，C错误；
D、待平板冷却凝固后需要倒过来放置，防止皿盖上的水珠滴落到培养基上，D正确。
故选D。
11．下列关于灭菌和消毒的叙述中，不正确的是（ ）
A．灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子
B．消毒和灭菌实质上是相同的
C．接种环用灼烧法灭菌
D．常用灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
【答案】B
【分析】
使用强烈的理化因素杀死物体内外一切微生物的细胞、芽孢和孢子的过程称为灭菌，常用的方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。消毒是指用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体体表或内部的一部分微生物的过程，常用的方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法等。
【详解】
A、灭菌是指采用强烈的理化因素杀死一定环境中所有微生物的细胞、芽孢和孢子的措施，是彻底杀死，A正确；
B、消毒是一种采用较温和的理化因素杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒物体基本无害的措施，是部分杀灭，故消毒和灭菌实质上不相同， B错误；
C、接种环用灼烧法灭菌，C正确；
D、常用灭菌方法有灼烧法、干热灭菌法、高压蒸汽灭菌法，D正确。
故选 B。
12．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧、干热灭菌等几种不同的处理，这些方法依次用于杀死哪些部位的杂菌（ ）
A．接种环、手、培养基、涂布器 B．高压锅、手、接种环、培养基
C．培养基、手、接种环、试管 D．接种环、手、高压锅、培养皿
【答案】C
【分析】
消毒是使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子）；杀菌是使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）。
【详解】
高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌；用酒精擦拭双手是消毒的一种方法；火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环、接种环等金属用具；干热灭菌一般适用于玻璃器皿的灭菌，如试管。C符合题意。
故选C。
13．下表所示为某微生物培养基的配方，有关叙述错误的是（ ）
成分
含量
成分
含量
NaNO3
3 g
FeSO4
0．01 g
K2HPO4
1 g
(CH2O)
30 g
琼脂
15 g
H2O
1 000 mL
MgSO4·7H2O
0．5 g
青霉素
0．1万单位
A．依物理性质划分，该培养基属于固体培养基；依用途划分，该培养基属于选择培养基
B．本培养基中青霉素的添加满足了微生物生长对特殊营养物质的要求
C．由培养基的原料可知，所培养的微生物可以是酵母菌或毛霉，其同化作用类型是异养型
D．若用该培养基分离能分解尿素的细菌，应除去青霉素和NaNO3，并应加入尿素
【答案】B
【分析】
各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。培养基按其特殊用途可分为加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。液体培养基中加入凝固剂琼脂可以制作固体培养基。
【详解】
A、从培养基成分看，配方中含有有琼脂等凝固剂，属于固体培养基；依用途划分，该培养基中加入青霉素，因此属于选择培养基，A正确；
B、本培养基中青霉素的添加是为了筛选能够抗青霉素的微生物，而非满足微生物生长对特殊营养物质的要求，B错误；
C、由培养基的原料可知，葡萄糖属于有机碳源，因此所培养微生物的同化作用类型是异养型，培养的微生物可以是酵母菌或毛霉，C正确；
D、若用该培养基分离能分解尿素的细菌，应以尿素为唯一氮源，故应除去青霉素和NaNO3，并应加入尿素，D正确。
故选B。
14．下列关于微生物培养及利用的叙述，正确的是（ ）
A．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物
B．酵母菌酿酒时，不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒
C．果胶经过果胶酶和果胶甲酯酶水解后的产物是半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯
D．尿素固体培养基在灭菌并完全冷却后再加入经过滤灭菌的尿素溶液
【答案】B
【分析】
果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一.它是由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物，不溶于水，果胶酶能够分解果胶，瓦解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁变得更容易。果胶酶并不特指某一种酶，而是分解果胶的一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶等。
【详解】
A、尿素固体培养基上只有能利用尿素的微生物可以正常生长，但不能迅速杀死其他微生物，A错误；
B、酵母菌酿酒时，只能利用糯米淀粉分解产生的葡萄糖发酵得到糯米酒，B正确；
C、果胶经过果胶酶和果胶甲酯酶水解后的产物是半乳糖醛酸和甲醇，C错误；
D、制备尿素固体培养基时，在加入尿素溶液后再灭菌，D错误。
故选B。
15．下列对菌落的表述不正确的是（ ）
A．并不是所有培养基上都能形成菌落
B．菌落的形状、大小、颜色等，可作为鉴别不同微生物的依据
C．一般情况下，培养基上的一个菌落可看做是一个种群
D．培养基上的每个菌落都是由单个菌体细胞大量繁殖而成
【答案】D
【分析】
菌落是指由微生物的一个细胞在或一堆同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的子细胞群体。
【详解】
A、菌落是在固体培养基上形成的，因此并不是所有培养基上都能形成菌落，例如液体培养基，A正确；
B、菌落的特征，如形状、大小、颜色等，可作为鉴别不同微生物的依据，B正确；
C、一般情况下，培养基上的一个菌落是由单个细胞经过分裂形成的，是同种生物，可看做是一个种群，C正确；
D、培养基上的菌落也可能是由2个或多个连在一起的菌体细胞大量繁殖而成的，D错误。
故选D。
16．某同学在做“微生物的分离与培养”实验时，下列灭菌方法中，操作正确的是（ ）
A．在高压蒸汽灭菌锅外层锅内加适量水，放入装有待灭菌物品的内桶，关闭排气阀，打开电源加热
B．在干热灭菌箱灭菌结束后，立即关掉电源，打开箱门，取出物品
C．采用紫外线照射灭菌时，可在物体表面喷洒适量石碳酸等化学抑菌剂，以加强消毒效果
D．在用灼烧法对接种环灭菌时，适当向灼烧后的接种环吹气，以加速其冷却
【答案】C
【分析】
实验室常用的灭菌方法：
1、灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌，此外，在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰燃烧来灭菌。
2、干热灭菌：能耐高温的，需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌。
3、高压蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121℃的条件下，维持15～30 min。
【详解】
A、在高压蒸汽灭菌锅外层锅内加适量水，放入装有待灭菌物品的内桶，打开电源加热，把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后，关闭排气阀，将锅密闭，A错误；
B、在干热灭菌箱灭菌结束后，立即关掉电源，等温度下降至室温后再打开箱门，取出物品，B错误；
C、采用紫外线照射灭菌时，可在物体表面喷洒适量石碳酸等化学抑菌剂，可以加强消毒效果，C正确；
D、在用灼烧法对接种环灭菌时，可将灼烧后的接种环接触菌种瓶内壁，以加速其冷却，D错误。
故选C。
17．下列能用固体培养基进行直接计数的是（ ）
A．一种癌细胞 B．浓缩培养的噬菌体 C．大肠杆菌 D．菊花组织细胞
【答案】C
【分析】
固体培养基可用于微生物的培养和计数，培养液中的细胞可用血细胞计数板进行计数。
【详解】
A、癌细胞培养液中的癌细胞可以用血细胞计数板直接计数，不能用培养基直接计数，A错误；
B、噬菌体是病毒，不能用培养基培养，在光学显微镜下不能观察到，B错误；
C、固体培养基上的大肠杆菌菌落可以直接用肉眼观察到，可以在固体培养基上直接计数，C正确；
D、菊花组织细胞中的细胞都连接在一起，无法直接计数，D错误。
故选C。
18．下列关于微生物培养基营养成分和作用的叙述，正确的是（ ）
A．微生物培养基只含有水、碳源、氮源和无机盐
B．蛋白胨能为微生物提供磷酸盐
C．牛肉膏能为微生物提供特殊营养物质
D．铵盐、硝酸盐是异养微生物的主要氮源
【答案】C
【分析】
培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；根据物理性质分为固体培养基和液体培养基，培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物种和氧气的要求。
【详解】
A、微生物培养基的配方中，一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有些培养基还需要加入一些特殊营养物质，A错误；
B、蛋白胨提供的主要营养有碳源、氮源和维生素，但不能提供磷酸盐，B错误；
C、牛肉膏提供的主要营养有碳源、氮源、磷酸盐和维生素，能提供特殊营养物质维生素，C正确；
D、异养微生物的主要氮源是有机氮源，D错误。
故选C。
19．下列操作属于灭菌方法的是（ ）
A．接种前用酒精棉球擦拭双手和工作台面
B．接种时将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中，并将涂布器放在火焰上灼烧
C．牛奶在80℃下煮15min以杀死其中的微生物
D．接种室用此紫外线照射30min以杀死物体表面或空气中的微生物
【答案】B
【分析】
灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外一切微生物的细胞、芽孢和孢子的过程，常用的方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌；消毒是指用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体体表或内部的一部分微生物的过程，常用的方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法等。
【详解】
A、接种前用酒精棉球擦拭双手和工作台面属于消毒，A不符合题意；
B、进行涂布平板操作前，要对涂布器进行灭菌，一般做法是先将涂布器浸在盛有70%酒精的烧杯中，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，属于灭菌，B符合题意；
C、牛奶在80℃下煮15min以杀死其中的绝大多数微生物属于消毒，C不符合题意；
D、接种室在使用前要进行紫外线照射照射30min，以杀死物体表面和空气中的微生物，属于消毒，D不符合题意。
故选B。
20．某科研小组用滤膜法测定饮用水中大肠杆菌的含量（所用滤膜孔径小于大肠杆菌）。下列叙述正确的是（ ）
A．大肠杆菌在含有酚红指示剂的培养基上培养得到的菌落呈红色
B．可根据培养基上红色菌落的数目估算出水样中大肠杆菌的数量
C．将滤膜转移培养后统计出的菌落数目往往比活菌的实际数目要多
D．血清、毒素、抗生素等不耐热生物制品可以采用滤膜过滤除去细菌
【答案】D
【分析】
滤膜法是检测水样中大肠杆菌群的方法；将一定量水样注入已灭菌的微孔薄膜的滤器中，经过抽滤，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴于伊红美蓝培养基（EMB培养基）上，经培养后计数和鉴定滤膜上生长的大肠杆菌菌落，依据过滤水样体积计算每升或每100毫升水样中的大肠杆菌菌群数；该方法操作简单、快速，主要适用于杂质较少的水样。
【详解】
A、大肠杆菌在含有伊红美蓝的培养基表面长出的菌落呈黑色，A错误；
B、将已知体积的饮用水过滤后，将滤膜放在加入伊红美蓝的培养基上（大肠杆菌菌落呈黑色），根据黑色菌落的数目，可计算出水样中大肠杆菌的数量，B错误；
C、将滤膜转移培养后统计菌落数目时，由于培养过程中两个或多个细胞可能生长在一起形成一个菌落，导致统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，C错误；
D、滤膜法经过抽滤，细菌被截留在滤膜上，故血清、毒素、抗生素等不耐热生物制品可以采用滤膜过滤除去细菌，D正确。
故选D。
21．如图是“微生物平板划线”示意图，划线的顺序为1→2→3→4→5，下列有关叙述正确的是（ ）
A．操作前用无水乙醇对接种人员的双手进行消毒处理
B．划线操作时，把培养皿盖完全打开后在酒精灯火焰上方进行
C．在5个区域中，最好选择最后区域的菌落
D．划线前后灼烧接种环的目的相同
【答案】C
【分析】
平板划线的操作的基本步骤是：
1、右手持接种环，经火焰灭菌，待凉后，在火焰旁打开盛有菌液的试管棉塞，并将试管口过火焰，将以冷却的接种环伸入菌液，沾取一环菌液，将试管口过火焰丙塞上棉塞。
2、左手斜持琼脂平板，皿盖打开一条缝，右手于火焰近处将接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖，接种环不应划破培养基表面。
3、烧灼接种环，杀灭环上残留菌液，待冷却（是否冷却，可先在培养基边缘处试触，若琼脂溶化，表示未凉，稍等再试），从第一区域划线的末端开始往第二区内划线，重复以上操作，在第三四五区内划线，注意不要将最后一区的划线与第一区相连。
4、将平板倒置，放入培养箱中培养。
【详解】
A、操作前用70%的酒精溶液对接种人员的双手进行消毒处理，A错误；
B、划线操作时，培养皿盖不要完全打开，且须在酒精灯火焰周围进行，以防空气中杂菌污染，B错误；
C、在5个区域中，最后区域更容易获得单个活细菌形成的菌落，故最好选择最后区域的菌落，C正确；
D、初次划线灼烧的目的是防止杂菌污染，其后划线后灼烧的目的是杀死上次划线结束后残留在接种环上的菌种，使下一个区域的菌种只来自上一个区域的末尾，最后一次灼烧的目的是防止菌体污染环境，故划线前后灼烧接种环的目的不相同，D错误。
故选C。
22．下列有关细菌纯培养的说法，不正确的是（ ）
A．每次划线后接种环要在酒精灯火焰上灼烧灭菌
B．培养基上的单个菌落都是一个细菌细胞的克隆
C．实验操作者接种前要用70%的酒精棉球擦手消毒
D．菌液梯度稀释后用涂布法接种，得到单菌落便于计数
【答案】B
【分析】
1、无菌技术的主要内容：
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；
③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
2、微生物常见的接种的方法：
①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
A、为杀死接种环上残留的菌种，每次划线后接种环要在酒精灯火焰上灼烧灭菌，A正确；
B、培养基上的单个菌落都是一个细菌细胞或几个同种细菌细胞的克隆，B错误；
C、对操作者的衣着和手要进行消毒，一般接种前要用70%的酒精棉球擦手消毒，C正确；
D、菌液梯度稀释后用涂布法接种，得到单菌落便于计数，D正确。
故选B。
23．在农田土壤的表层自生固氮菌较多，用表层土制成的稀泥浆接种到特制的培养基上培养，可将自生固氮菌与其他细菌分开，对培养基的要求是（ ）
①加抗生素 ②不加抗生素 ③加氮素 ④不加氮素 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦39℃恒温箱中培养 ⑧28～30℃恒温箱中培养
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧ C．②④⑤⑧ D．②④⑥⑦
【答案】C
【分析】
1、自生固氮微生物属于细菌，其细胞壁的主要成分是肽聚糖，对抗生素敏感。
2、自生固氮微生物是一类能够独立进行固氮的微生物。
3、自生固氮微生物的代谢类型是异养需氧型。
【详解】
①②自生固氮微生物属于细菌，其细胞壁的主要成分肽聚糖，对抗生素敏感，培养基不能添加抗生素，①错误，②正确；
③④自生固氮微生物是一类能够独立进行固氮的微生物，培养基中可以不添加氮素，③错误，④正确；
⑤⑥自生固氮微生物的代谢类型是异养需氧型，培养基必须添加葡萄糖作为碳源和能源，⑤正确，⑥ 错误；
⑦⑧应在28°C～30°C温度下培养，这是因为该温度是自生固氮微生物的最适宜温度，⑦错误，⑧正确。
综上所述②④⑤⑧，ABD错误，C正确。
故选C。
24．菜籽粕含有35%~45%蛋白质，是畜禽饲料的重要原料，但其中的单宁等抗营养因子限制了菜籽粕的应用。研究者将不同菌种接种到菜籽粕与麸皮制成的固体培养基中发酵48h，测定菜籽粕中单宁的含量，结果如图。下列相关叙述错误的是（ ）
A．菜籽粕与麸皮为微生物提供碳源和氮源
B．接种后需对培养基进行高压蒸汽灭菌
C．黑曲霉菌对单宁的去除效果最为理想
D．实验所用菌种均有细胞壁但成分不同
【答案】B
【分析】
由柱形图分析可知，4种菌种处理的发酵菜籽粕中的单宁含量都低于对照组，去除单宁效果由大到小的排序为黑曲霉菌＞植物乳酸菌＞酿酒酵母菌＞枯草芽孢杆菌。
【详解】
A、菜籽粕含有较多的粗蛋白和维生素等物质，麦麸含有粗纤维、蛋白质和微量元素，故菜籽粕与麸皮能够为微生物提供碳源和氮源，A正确；
B、接种前的培养基需要进行高压蒸汽灭菌，培养基的制作过程为：计算、称量、溶化、调pH、灭菌、倒平板，B错误；
C、由柱形图分析可知，黑曲霉处理的发酵菜籽粕中的单宁含量最低，由此说明黑曲霉菌对单宁的去除效果最为理想，C正确；
D、实验用的植物乳酸菌和枯草芽孢杆菌是原核生物，细胞壁主要成分是肽聚糖，酵母菌细胞壁的主要成分是葡聚糖和甘露聚糖，黑曲霉菌细胞壁的主要成分是几丁质，D正确。
故选B。
25．在分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种（甲）、培养结果（乙）如下图，有关叙述正确的是 （ ）
A．在第c区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
B．划线操作时，如不划线操作时，如接种环不慎划破培养基，可以继续正常操作
C．接种过程中至少需要对接种环灼烧6次
D．甲中d区域为划线的起始位置
【答案】D
【分析】
平板划线的操作的基本步骤是：
1、右手持接种环，经火焰灭菌，待凉后，在火焰旁打开盛有菌液的试管棉塞，并将试管口过火焰，将以冷却的接种环伸入菌液，沾取一环菌液，将试管口过火焰丙塞上棉塞。
2、左手斜持琼脂平板，皿盖打开一条缝，右手于火焰近处将接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖，接种环不应划破培养基表面。
3、烧灼接种环，杀灭环上残留菌液，待冷却（是否冷却，可先在培养基边缘处试触，若琼脂溶化，表示未凉，稍等再试），从第一区域划线的末端开始往第二区内划线，重复以上操作，在第三四五区内划线，注意不要将最后一区的划线与第一区相连。
4、将平板倒置，放入培养箱中培养。
【详解】
A、在第c区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于第一区域的划线末端，A错误；
B、划线操作时，如接种环不慎划破培养基，则该培养基将不能继续使用，B错误；
C、每次划线前后都需要将接种环灼烧灭菌，因此按照图中划线顺序（d→c→b→a），整个划线过程需要对接种环灼烧5次，C错误；
D、每次划线的菌种来自上一区域的末端，因此划线的起始区域菌落最多，由图乙可知，图甲中的d区域菌落多，为划线的起始位置，D正确。
故选D。
26．漆酶属于木质素降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述不正确的是 （ ）
A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品
B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落
C．在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化
D．斜面培养基中含有大量营养物，可在低温下临时保存菌株
【答案】A
【分析】
1、分析题图：分离、纯化和保存菌株的一般过程为：取样→制成样品悬液→涂布→划线→接种。
2、分离和纯化细菌需多次进行选择培养。
3、利用平板划线法纯化目的菌时，在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环。
【详解】
A、根据题意可知，漆酶属于木质降解酶类，因此森林的土壤是分离产漆酶菌株的首选样品，生活污水中含有大量微生物，但不一定含有产漆酶的微生物，A错误；
B、产漆酶能分解木质素，筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落，从而获得漆酶菌株，B正确；
C、平板划线法可以用来分离和纯化微生物，在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化，C正确；
D、保存菌种一般在低温下保存，将菌株接种于固体斜面培养基，菌落长成后可在4℃的冰箱中临时保藏，D正确。
故选A。
27．某学生为了观察根瘤菌（共生固氮菌：只有共生才能固氮）的菌落形态，做了两组实验；A组把根瘤菌接种到无氮培养基中，其他营养成分均齐全；B组把根瘤菌接种到全素培养基中（各种营养成分均齐全）。两组根瘤菌的固氮量与菌落的情况是（ ）
A．A组的固氮量与菌落比B组的多且大 B．B组的固氮量与菌落比A组的多且大
C．A组的固氮量与菌落大小与B组几乎一样 D．A、B组均不能固氮，B组能形成菌落
【答案】D
【分析】
分析题意可知，本实验的自变量为氮元素的有无，因变量为菌落的生长状况，其余无关变量应保持等量且适宜，据此分析作答。
【详解】
因共生固氮菌只有和其它生物，如和豆科植物共生形成根瘤后才能固氮，故A组把根瘤菌接种到无氮培养基中，其B组把根瘤菌接种到全素培养基中，因缺少共生物，两组均不能固氮，但B组营养齐全，可以形成菌落。D符合题意。
故选D。
28．甲、乙、丙是三种微生物，下表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖；甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是（ ）
粉状硫
10 g
K2HPO4
4 g
FeSO4
0.5 g
蔗糖
10 g
（NH4）2SO4
0.4 g
H2O
100 mL
MgSO4
9.25 g
CaCl2
0.5 g
Ⅰ
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
Ⅱ
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
＋
Ⅲ
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
注：“＋”表示培养基中加入了这种物质，“－”表示培养基中没有加入这种物质。
A．甲、乙、丙都是异养型微生物
B．甲、乙都是自养型微生物，丙是异养型微生物
C．甲是异养型微生物，乙是固氮微生物，丙是自养型微生物
D．甲是固氮微生物，乙是自养型微生物，丙是异养型微生物
【答案】D
【分析】
据表分析：Ⅰ培养基的特点是缺氮，能在这样的培养基上存活的只能是固氮微生物；Ⅱ培养基的特点是没有有机碳源，是培养自养微生物的培养基；Ⅲ培养基是适宜异养微生物生长的培养基。
【详解】
根据题意可知，甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能，而Ⅰ培养基缺氮，说明甲能够自身固氮，属于固氮微生物；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，而甲和丙都不能，Ⅱ培养基中没有有机碳源，说明乙能够合成有机物，属于自养微生物；而丙不能在Ⅰ培养基，说明不能固氮；又不能在Ⅱ培养基中生长，说明不能合成有机物，只能在Ⅲ培养基中生长，说明属于异养微生物。
故选D。
29．下列有关培养基和菌种鉴定的叙述，错误的是（ ）
A．根据培养基的物理性质可将其分为液体培养基和固体培养基
B．可利用固体培养基上菌落的特征来判断和鉴别细菌的类型
C．利用刚果红培养基上是否形成透明圈来筛选纤维素分解菌
D．在无氮培养基中加入酚红指示剂鉴定尿素分解菌
【答案】D
【分析】
培养基按物理性质分可分固体培养基和液体培养基，液体培养基中加入凝固剂可以制成固体培养基；固体培养基一般用于微生物的鉴别、分离和计数，液态培养基常用于扩大化生产，观察细菌运动；刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素复合物便不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌；分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。
【详解】
A、根据培养基的物理性质可将其分为液体培养基和固体培养基，A正确；
B、每一种细菌在固体培养基上形成固定的菌落特征，这些特征对菌种识别、鉴定有一定意义，B正确；
C、当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌，C正确；
D、在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可用来鉴定尿素分解菌，D错误。
故选D。
二、多选题
30．下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的操作结果。下列叙述中错误的是（ ）
A．甲中涂布前要将涂布器灼烧接着涂菌液
B．甲、乙操作中只有甲可以用于微生物的计数
C．乙中接种环需要灼烧5次
D．乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端
【答案】AC
【分析】
1、平板划线法和稀释涂布平板法都能纯化细菌，但平板划线法不能计数，稀释涂布平板法能使细菌分离成单个，便于计数。
2、关于平板划线法中灼烧接种环的次数，接种前灼烧一次，是为了避免接种环上可能存在的杂菌污染菌种，以后每次接种前灼烧接种环，是为了杀死上次划线结束时接种环上残留的菌种；划线结束时灼烧接种环，是为了及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
【详解】
A、为防止杂菌污染，题图甲中的涂布平板操作 ，涂布前要将涂布器灼烧，冷却8~10 s后才能进行涂布，若灼烧后立即涂布，则会将菌体杀死，A错误；
B、甲是稀释涂布平板法，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，通过统计菌落数，可以推测出菌液中微生物的数量，乙是平板划线法，接种环在划线前后都要灭菌（杀死残留在接种环上的菌种），平板划线法能用于菌种的分离纯化，无法计数，因此只有甲可以用于微生物的计数，B正确；
C、乙是平板划线法中，在每次划线前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环，乙总共划线5次，接种环需要灼烧6次，C错误；
D、乙中连续划线的起点是上一次划线的末端，这样能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个活菌繁殖而来的菌落，D正确。
三、综合题
31．肺炎克雷伯菌是肠杆菌科细菌，常存在于人体上呼吸道和肠道，当机体免疫力降低时，经呼吸道进人肺内而引起相关病症。医学实验室用中国蓝培养基培养克雷伯菌，连续培养24小时和48小时结果分别如图（a）和图（b）所示。
中国蓝培养基的配方（每升）：蛋白胨10.0g 牛肉膏粉3.0g 乳糖10.0g 氯化钠5.0g琼脂13.0g 中国蓝0.05g 玫红酸0.1g，水添加至1L （最终pH7.0±0.2）
（1）本实验使用了_____法接种克雷伯菌，培养基中琼脂的作用是_____，实验室可用_____法长期保存该菌种。
（2）根据培养基的配方可知，培养基一般都含有水、_____、_____和_____四类营养物质，菌落数目统计时，选取菌落数目的范围在_____个的平板进行计数。
（3）此培养基中的中国蓝为指示剂，分解乳糖的细菌在培养基上形成蓝色菌落，不分解乳糖的细菌在培养基上形成淡红色的透明菌落。据此判断，中国蓝培养基属于_____培养基。
（4）在培养克雷伯菌时，将接种的培养基和一个未接种的培养基都放入恒温箱中培养，这样操作的目的是_____。
【答案】平板划线 作为凝固剂 甘油管藏 碳源 氮源 无机盐 30~300 鉴别 检测培养基灭菌是否彻底
【分析】
克雷伯菌属于细菌，可以用培养基直接培养。培养基中一般需要具备水、碳源、氮源、无机盐等营养物质。接种微生物一般有平板划线法、稀释涂布平板法、穿刺接种和斜面接种，根据所培养微生物的特性和实验目的选择合适的接种方式。根据图中培养结果，本实验用了平板划线法，48小时时的菌落数目多于24小时。
【详解】
（1）本实验用了平板划线法接种克雷伯菌，培养基中琼脂的作用是作为凝固剂，使培养基呈现固态，实验室用甘油管藏法长期保存该菌种。
（2）根据培养基的配方可知，培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐四类营养物质，菌落数目统计时，选取菌落数目的范围在30~300的平板进行计数。
（3）中国蓝指示剂对不同菌种所形成的菌落呈现不同颜色，据此判断，中国蓝培养基属于鉴别培养基。
（4）在培养克雷伯菌时，将接种的培养基和一个未接种的培养基都放入恒温箱中培养，这样操作的目的是检查培养基灭菌是否彻底。若空白培养基上长出菌落，说明培养基灭菌不彻底。
【点睛】
本题考查微生物实验室培养的基本内容，要求考生熟记课本内容，并理解应用。
32．开发新能源是解决全球能源危机的有效途径，利用微生物生产油脂是开发新能源的重要方向。科研人员发现某些酵母菌能将碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂在菌体内转化为具有商业价值的脂类。回答下列问题：
（1）为了获得产油酵母菌种，科研人员将土壤样品制成悬浊液，置于以甘油为唯一碳源的液体培养基中进行选择培养，选择培养的目的是_________。甘油进入产油酵母菌体内的主要作用是__________（答出两点）。
（2）准确移取0．1mL选择培养液，采用_________法将其接种于固定培养基上培养2~4d，形成分布均匀的菌落。挑取平板上的单菌落置于载玻片上，加热固定后用苏丹III染液染色，再置于显微镜下观察，若酵母菌细胞内出现__________色的脂肪颗粒，则说明酵母菌细胞中已有脂肪积累。
（3）为获取菌体内的油脂，科研人员将产油酵母菌置于一定浓度的盐酸中，浸泡24h，沸水浴15~20min，此步骤的目的是_________。再将得到的液体冷却后加入氯仿，充分振荡后离心，取氯仿层经过处理得到油脂，采用氯仿萃取脂肪的原理是_________。
【答案】筛选产油酵母菌并增加其浓度 为酵母菌的生命活动提供能量，为合成其他有机物提供原料 涂布平板 橘黄 破碎细胞，释放细胞中的物质 油脂易溶于氯仿
【分析】
筛选目的微生物时应该使用只有目的微生物能够生存，而其他微生物不能生存的选择培养基。选择培养基是指通过培养混合的微生物，仅得到或筛选出所需要的微生物，其他不需要的种类在这种培养基上是不能生存的。
【详解】
（1）以甘油为唯一碳源的液体培养基中进行选择培养，能分解甘油的微生物能大量繁殖，即筛选产油酵母菌并增加其浓度。甘油作为有机碳源，在产油酵母菌体内不仅能氧化分解提供能量，同时为合成其他有机物提供原料。
（2）由题干“形成分布均匀的菌落”可知，接种方法为稀释涂布平板法，苏丹III染液把脂肪染成橘黄色。
（3）产油酵母菌置于一定浓度的盐酸中，浸泡24h，沸水浴15~20min，目的是破碎细胞，释放细胞中的物质。
（4）氯仿是有机溶剂，依据相似相溶原理，脂类易溶于有机溶剂，且与水不互溶。
【点睛】
本题考查筛选目的微生物的原理和方法，掌握无菌技术，微生物的接种方法，把相关知识融合进题中，解决问题。
33．石油田的土壤中可能含有丰富的产油脂芽孢杆菌，该微生物合成的油脂是制备生物柴油的新型原料。回答下列问题：
（1）若要分离土壤中产油脂芽孢杆菌，主要实验步骤：取样→___________→___________→培养→___________。
（2）实验操作前，在密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能___________。实验结束时，培养微生物用的培养基要___________处理，才能倒掉。
（3）选择培养产油脂芽孢杆菌的培养基中加的主要碳源是___________。制备醋酸菌初筛平板时，需要将培养基的pH调至___________性。用平板培养细菌时一般需要将平板___________（填“倒置”或“正置”）。
（4）单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是___________。
【答案】稀释 涂布（或平板划线） 挑选菌落 破坏DNA结构 灭菌 石油 中性或微碱性 倒置 在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
【分析】
消毒和灭菌的辨析
项目
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理、化学或生物等方法
仅杀死物体表面或内部一部分微生物(不包括芽孢和孢子)
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药物消毒法
用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理
化方法
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具
湿热灭菌(如：高压蒸汽灭菌法)
培养基及容器的灭菌
【详解】
（1）油田的土壤中可能含有丰富的产油脂芽孢杆菌，若要分离土壤中产油脂芽孢杆菌，取样后首先应进行稀释，然后通过涂布平板法或平板划线法接种到以石油为唯一碳源的选择培养基中培养，在该培养基上能生长的菌落就是目的菌落，可挑选后进一步培养，故步骤为：取样→稀释→涂布（或平板划线）→培养→挑选菌落。（2）实验操作前，在密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能破坏DNA结构。实验结束时，培养微生物用的培养基要通过灭菌，消灭其中所有微生物，然后才能倒掉，以避免污染环境。
（3）选择培养产油脂芽孢杆菌的培养基中加的主要碳源是石油。醋酸菌属于细菌，培养基的最适pH为为微碱性或中性，制备醋酸菌初筛平板时，需要将培养基的pH调至中性或微碱性。用平板培养细菌时一般需要将平板倒置，以防止冷凝水污染培养基。
（4）在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征，单个细菌在平板上会形成菌落，可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物。
【点睛】
细菌的最适pH为中性或微碱性，霉菌的的最适pH为酸性。
34．科研人员从青藏高原祁连山地区的土壤中分离出一株高效耐低温原油降解菌YF28—1（8），应用该菌能够提高高寒地区石油等烃类污染物的分解效率，为我国的环境保护事业做岀贡献。请回答相关问题
（1）选择青藏高原祁连山地区进行菌种筛选，原因是_______________________________________。
（2）筛选原油降解菌的培养基中应加入_________作为唯一碳源；从功能上看，该培养基属于______培养基。
（3）在实验室中，玻璃和金属器材一般采用________方法进行灭菌。用平板划线法纯化细菌时，第2次划线及其以后划线总是从上次划线的末端开始，目的是___________________________________。
（4）用稀释涂布平板法培养细菌，要定期取样进行菌落计数，一般选择菌落数在____________的平板进行计数。
【答案】该地区的微生物更耐低温（或能找到高效耐低温原油降解菌） 原油（或石油） 选择 干热灭菌 将聚集的微生物逐渐稀释以便获得单个菌落 30～300
【分析】
采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。灭菌常用的方法有化学试剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌等。可根据不同的需求，采用不同的方法，如培养基灭菌一般采用湿热灭菌，空气则采用过滤除菌。
【详解】
（1）选择青藏高原祁连山地区进行菌种筛选，原因是该地区的微生物更耐低温（或能找到高效耐低温原油降解菌）。
（2）筛选原油降解菌的培养基中应加入原油（或石油）作为唯一碳源；从功能上看，该培养基属于选择培养基。
（3）在实验室中，玻璃和金属器材一般采用干热灭菌。用平板划线法纯化细菌时，第2次划线及其以后划线总是从上次划线的末端开始，目的是将聚集的微生物逐渐稀释以便获得单个菌落。
（4）用稀释涂布平板法培养细菌，要定期取样进行菌落计数，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
【点睛】
本题主要考查微生物培养的相关知识，其中准确理解微生物的分离培养方法，是解题的关键。
35．下表是某种微生物培养基的配方表，请据表回答下面的问题：
牛肉膏
蛋白胨
NaCl
琼脂
蒸馏水
0．5g
1 g
0．5 g
1 g
200 mL
（1）此培养基的营养成分有五类，其中蛋白胨提供的营养物质是_________________。
（2）在培养基制备过程中，各种成分溶化后分装前，必须的操作是_________。
（3）在农业生产研究上，常需要进行微生物的培养和计数。如下图是利用______法进行微生物接种，把聚集的菌种逐步分散到培养基的表面。为达到这一目的，操作上应注意：___________________（至少答两项）。
【答案】碳源、氮源、维生素 调节pH 平板划线法 ①每次划线前要灼烧接种环；②冷却后从上一区划线末端开始划；③首尾区不重叠（任选两项）
【分析】
培养基的营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。
【详解】
（1）培养基的营养成分有五类，其中蛋白胨提供的营养物质是碳源、氮源、维生素。
（2）在培养基制备过程中，各种成分溶化后分装前，要调节pH。
（3）图示为平板划线法接种微生物；该接种方法的原理是把聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。为达到这一目的，操作上应注意：每次划线前接种环进行灼烧灭菌，冷却后从上一区划线的末端开始划，以确保下一次划线的菌种来自上一次的末端，首尾区不相连。
【点睛】
本题考查微生物的分离和培养，要求考生识记培养基的营养构成，掌握制备培养基的步骤；识记接种微生物常用的两种方法，尤其是平板划线法的相关操作，能结合所学的知识准确答题。
36．在实验室培养微生物，一方面需要为培养的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。请回答下列相关问题：
（1）培养基能为培养的微生物提供营养。各种培养基的具体配方不同，但一般都含有______、_________、_________、_______；另外，培养基还需要满足微生物对_______、______、______的要求。
（2）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵对实验操作的空间、操作者的衣着和手，需进行清洁和______ （填“消毒”或“灭菌”）；对用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等需进行______ （填“消毒”或“灭菌”）。
（3）微生物接种的方法很多，其核心都是要防止杂菌的污染，保证培养物的纯度。微生物接种最常用的方法______和______。
【答案】水 碳源 氮源 无机盐 pH 特殊营养物质 氧气 消毒 灭菌 平板划线法 稀释涂布法
【分析】
营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
无菌技术（1）关键：防止外来杂菌的入侵；（2）具体操作①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
【详解】
（1）各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
（2）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，对实验操作的空间、操作者的衣着和手，需进行清洁和消毒，对用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等需进行灭菌。
（3）常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布法。
【点睛】
本题主要考查微生物实验室培养的相关知识，意在考查考生对相关知识的理解，把握知识间的内在联系的能力。
37．回答下列与细菌培养相关的问题
（1）在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________（填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”）。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是_______________________。硝化细菌在没有碳源的培养基上_______（填“能够”或“不能”）生长，原因是_________________________。
（2）用平板培养细菌时一般需要将平板________（填“倒置”或“正置”）。
（3）单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是在一定的培养条件下，_________________________________。
（4）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
【答案】蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同 能够 硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源 倒置 不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征 灭菌
【分析】
1、微生物培养基的营养构成：①各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐；②不同培养基还要满足不同微生物对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2、配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的注意事项：①倒平板的温 度一般50℃左右适宜，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固；②平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
【详解】
（1）葡萄糖只能为细菌提供碳源，硝酸钠为细菌提供无机盐，而蛋白胨既可以为细菌碳源，也可以为细菌提供氮源；由于不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同，所以通常在制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH；硝化细菌属于化能自养型微生物，其可以利用氨氧化释放的能量将空气中的二氧化碳固定为有机物，因此硝化细菌可以在无碳培养基中生长。
（2）用平板培养细菌时，一般需要将平板倒置培养，以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
（3）由于每一大类微生物都有其独特的细胞形态，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征，因而其菌落形态特征也各异，因此根据菌落的形态、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物。
（4）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过灭菌处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物，以免污染环境。
【点睛】
解答本题的关键是识记微生物培养基的成分、培育条件、培养过程以及注意事项，能够根据不同微生物的代谢类型判断其所需营养成分的种类，进而结合题干要求分析答题。
根据微生物的分离和培养的知识，回答下列问题：
38．在微生物的实验室培养过程中，获得纯净培养物的关键是__________________。
39．配制培养基时，各种成分在溶化后分装前必须调节_____。
40．实验结束时，使用过的培养基应进行灭菌处理后才能倒掉，这样做的目的是_______。
41．以下材料请选择合适的方法消毒或灭菌：
①培养细菌用的培养基：______________；
②实验操作者的双手：____________；
③实验过程中的接种环：_______________。
42．在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的菌种原液被污染了？为什么？__________，_____________________。
【答案】
38．防止外来杂菌的入侵
39．pH
40．避免杂菌污染环境
41． 高压蒸汽菌 用（70%）的酒精消毒 灼烧灭菌
42． 不能 因为杂菌可能来自培养基或来自培养过程
【分析】
1、无菌技术：泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法,是成功地培养微生物的关键。
2、消毒和灭菌：
（1）消毒：用温和的化学或物理方法，杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢、孢子）的过程。
（2）消毒的方法：①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min；②巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或80 ℃ 下煮15min(低温消毒法)；③化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源；④紫外线消毒：对实验室空气消毒。
（3）灭菌：以强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物（包括芽孢、孢子） ，达到完全无菌的过程。
（4）灭菌的方法：①灼烧灭菌：微生物学实验室的接种环、接种针、试管口等的灭菌②干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。适用于玻璃器皿(如试管、培养皿、吸管、注射器)和金属器具(如针头、镊子、剪刀等)的灭菌。③高压蒸汽灭菌：100kPa、121 ℃下维持15-30min. 最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。④其他灭菌方法：紫外线、超声波、微波、化学药物消毒等。
3、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：
（1）计算根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制100mL的培养基时，各种成分的用量。
（2）称量：准确地称取各种成分。牛肉膏比较黏稠，可以用玻棒挑取，放在称量纸上称量。牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖。
（3）溶化：将称好的牛肉膏连同称量纸一同放人烧杯，加入少量的水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。往烧杯中加人称量好的蛋白胨和氯化钠，用玻棒搅拌，使其溶解。加入琼脂，加热使其熔化。在此过程中，不断用玻棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。当琼脂完全熔化后，补加自来水至100 mL。
（4）灭菌将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压灭菌锅，在 100kPa，温度为121℃条件下灭菌15- 30 min。将培养皿用几层旧报纸包紧，5-8套培养皿作一包，包好后放入干热灭菌箱内，在160-170℃下灭菌2h。
（5）倒平板：待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
38．
在微生物的实验室培养过程中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。
39．
配制培养基时，各种成分在溶化后分装前必须调节pH。
40．
实验结束时，使用过的培养基应进行灭菌处理后才能倒掉，这样做的目的是避免杂菌污染环境。
41．
①培养细菌用的培养基：高压蒸汽菌；
②实验操作者的双手：用（70%）的酒精消毒；
③实验过程中的接种环：灼烧灭菌。
42．
在培养基上还有其他杂菌的菌落，不能肯定该大肠杆菌的菌种原液被污染了，因为杂菌可能来自培养基或来自培养过程。
【点睛】
本题考查微生物的培养和分离，重点考查培养基的制备过程,要求考生识记培养基制备的具体步骤，掌握各步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确判断各选项。
43．为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌的分离等工作。回答下列问题
（1）该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空平板先行培养了一段时间，这样做的目的是_______________________；然后，将1mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0．1mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为_________________。
（2）该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过______灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是___________________________
（3）示意图A和B中，______表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
【答案】检测培养基平板灭菌是否合格 3．8×107 灼烧 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落 B
【分析】
实验室常用的灭菌方法：
（1）灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。此外，在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰燃烧来灭菌；
（2）干热灭菌：能耐高温的，需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌；
（3）高压蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100kPa，温度为121℃的条件下，维持15～30min。
【详解】
（1）该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空平板先行培养了一段时间，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格；然后，将1mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为（39+38+37）÷3÷0.1×100×1000=3.8×107。
（2）该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。
（3）示意图A和B中，图B表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果，图A表示的是用平板划线法接种培养后得到的结果。
【点睛】
本题考查微生物的分离和培养，意在考查学生识记所学知识要点，把握知识间的内在联系，形成知识网络的能力，同时获取题干信息准确答题。
从自然菌样筛选较理想生产菌种的一般步骤是：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。
44．不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养噬盐菌的菌样应从__________环境采集。
45．富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，使其群落中的数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择____________________的培养基，并在__________条件下培养。
46．下面两组图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
获得图A效果的接种方法是__________，获得图B效果的接种方法是__________。
47．配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行__________，接种前要进行____________，在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在______条件下进行。
【答案】
44．海滩等高盐
45． 以淀粉为唯一碳源 高温
46． 稀释涂布平板法 平板划线法
47． pH调整 高压蒸汽灭菌 无菌
【分析】
自然界中目的菌株的筛选的依据是根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找．实验流程为土壤取样→样品的稀释→将稀释液涂布到以尿素为唯一氮源的培养基上→挑选能生长的菌落→鉴定．常用的接种方法主要有平板划线法与稀释涂布平板法。
44．
噬盐菌能适应高盐环境，故噬盐菌的菌样应从海滩等高盐环境采集｡
45．
产耐高温淀粉酶微生物能产生耐高温淀粉酶说明其碳源是淀粉，应选择以淀粉为唯一碳源的培养基，并在高温条件下培养。
46．
图A菌落分布较均匀，接种方法是稀释涂布平板法，图B菌落集中呈线状，接种方法是平板划线法。
47．
配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行调整pH，接种前要进行高压蒸汽灭菌，在实验中要注意在无菌条件下进行。
【点睛】
本题主要考查微生物的筛选与培养，意在强化学生对相关知识的识记、理解与运用。
酸牛奶酒是在牛奶中加入乳酸菌和酵母菌混合发酵而成的一种乳饮料。请回答下列有关问题：
48．牛奶在加入菌种前应进行___________（填消毒或灭菌），酵母菌不具有的结构有___________（填拟核、叶绿体或细胞壁）。
49．已知“改良MC琼脂培养基”中含有碳酸钙，遇酸溶解而使培养基变得透明；“孟加拉红琼脂培养基”含氯霉素，可抑制绝大多数细菌的生长。对乳酸菌进行计数时应选择上述______培养基，用______（填方法）接种，挑选出的菌落进行计数。
50．对乳酸菌、酵母菌双菌混合培养和各自单独培养过程中的活菌数进行定时检测，由结果可知，双菌混合培养时两种菌的最大活菌数均高于其单独培养时，从代谢产物角度分析，其原因可能是______________________________________、除了上述的活菌计数外，_______________ 也是测定微生物数量的常用方法。
【答案】
48． 消毒 拟核、叶绿体
49． 改良MC琼脂培养基 稀释涂布平板法
50． 酵母菌和乳酸菌可以相互利用对方的代谢产物，从而相互促进生长 显微镜直接计数法
【分析】
1、酵母菌属于真核生物，也是兼性厌氧型生物，既能进行有氧呼吸也能进行无氧呼吸。
2、 接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法，其中稀释涂布平板法可对微生物进行计数。
48．
为避免目的菌被杀死，牛奶在加入菌种前应进行消毒处理；酵母菌为真菌 ，无拟核，也无叶绿体。
49．
根据题意可知，“孟加拉红琼脂培养基”含氯霉素，可抑制乳酸菌的生长，因此对乳酸菌进行计数时应选择改良MC琼脂培养基培养基；对微生物计数需要用稀释涂布平板法方法接种，挑选出具有透明圈的菌落进行计数。
50．
结合题意可知，双菌培养时两种菌的最大活菌数均高于其单独培养时，从代谢产物角度分析，其原因可能是酵母菌和乳酸菌可以相互利用对方的代谢产物，从而相互促进生长；除稀释涂布平板法可以计数外，显微镜直接计数法 也是测定微生物数量的常用方法。
【点睛】
本题主要考查微生物分离和培养的相关知识，意在考查考生对所学知识的理解，把握知识间内在联系的能力。
大肠杆菌是寄生于人和动物肠道中的细菌，其代谢产物能与染料伊红美蓝反应，使菌落呈黑色。下面是其培养基配方：
成分
蛋白胨
乳糖
磷酸二氢钾
琼脂
蒸馏水
2%伊红水溶液
0．5%美蓝水溶液
含量
10g
10g
2g
20~30g
1000ml
20ml
13ml
回答下列问题：
51．培养细菌时，培养基PH一般调至__________________。该培养基中，蛋白胨为大肠杆菌提供的主要营养有_____________________和维生素。从功能上分类，该培养基属于____________培养基。
52．对该培养基进行灭菌时，可采用_____________法。在接种大肠杆菌前，需先将灭菌后的空白培养基放在恒温箱中培养一段时间，观察是否有菌落生成，其目的是_______________________________________________________________________。
53．为检测严重污染水体中大肠杆菌数量，将水样适当稀释后，取样涂布在上述平板培养基中，应选择颜色为____________的菌落进行计数。该方法是通过统计平板上的菌落数来推测样品中的活菌数，其原理是____________________________________________。
【答案】
51． 中性或微碱性 碳源、氮源 鉴别
52． 高压蒸汽灭菌 检测培养基制备是否合格（灭菌是否彻底）
53． 黑色 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌
【分析】
1、微生物培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2、鉴别、培养大肠杆菌可使用伊红-美蓝培养基，菌落呈黑色或紫黑色有金属光泽。
51．
微生物培养时需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求，如培养细菌时需将pH调至中性或微碱性；蛋白胨既可以为大肠杆菌提供碳源，也可以为大肠杆菌提供氮源；据表格信息可知，该培养基成分中伊红-美蓝水溶液，故属于鉴别培养基。
52．
对该培养基进行灭菌时，可采用高压蒸汽灭菌法；在接种大肠杆菌前，需先将灭菌后的空白培养基放在恒温箱中培养一段时间，观察是否有菌落生成，其目的是检测培养基制备是否合格（灭菌是否彻底）：若有菌落生成，则证明灭菌不彻底。
53．
大肠杆菌的代谢产物能与染料伊红美蓝反应，使菌落呈黑色，为检测严重污染水体中大肠杆菌数量，将水样适当稀释后，取样涂布在上述平板培养基中，应选择颜色为 黑色的菌落进行计数；通过统计平板上的菌落数来推测样品中的活菌数的原理是当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。
【点睛】
本题考查了微生物分离与培养的有关知识，要求考生能够根据实验原理补充实验步骤，识记培养基的主要成分，并能结合题意分析作答。
下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：
54．甲、乙两种接种方法所用的接种工具分别是_________和_________；对这两种接种工具进行灭菌的方法是_________。
55．平板划线时，为保证微生物的数目随划线次数的增加而逐步减少，每次划线都要从_________开始，平板划线结束后，最后一次划的线不能与第一次划的线_________________。
56．接种操作之所以一定要在火焰附近进行，是因为__________________。
57．下图是接种后培养的效果图解，据此判断接种时采用的是甲、乙两种接种方法中的_______________。
58．假设用图乙所示方法接种培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是_________________________。
【答案】
54． 接种环 涂布器 灼烧
55． 上一次划线末端 相连(或相接、相交、交叉等)
56．火焰附近存在着无菌区域
57．乙
58．稀释倍数不够，菌液的浓度太高
【分析】
1．微生物常见的接种的方法
①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
2．分析题图：图甲的接种方法是平板划线法，图乙的接种方法为稀释涂布平板法。
54．
根据图甲接种后的结果可知，甲接种微生物采用的是平板划线法，这种方法的接种工具是接种环；图乙在培养基中央滴了一滴培养液，可见其利用的是稀释涂布平板，该方法的接种工具是涂布器。对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是灼烧灭菌和酒精消毒。
55．
平板划线法接种时，为保证微生物的数目随划线次数的增加而逐步减少，每次划线都要从上一次划线的末端开始，平板划线结束后，最后一次划的线不能与第一次划的线相交（相接、相连、交叉等）。
56．
由于火焰附近存在着无菌区域，因此为了防止杂菌污染，接种操作一定要在火焰附近进行。
57．
由图可知，菌落均匀的分布在培养皿的培养基上，说明该接种方法为稀释涂布平板法，为方法乙。
58．
假设利用稀释涂布平板法接培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是：①稀释倍数不够，菌液的浓度太高。
【点睛】
本题结合图解，考查微生物的分离和培养，要求考生掌握接种微生物的两种方法及无菌技术，能正确分析题图，再结合所学的知识准确答题。
59．酸牛奶由新鲜牛奶经乳酸菌发酵制成。经乳酸发酵后，牛奶中的乳糖可转化成葡萄糖和半乳糖，进而转变为乳酸等小分子化合物，易于消化。乳酸菌还能改变肠道环境，抑制有害菌繁殖，调整胃肠道菌群的平衡。低温酸奶一般在2-6℃可储藏21天，在室温下乳酸杆菌加快繁殖，会因过度生长发酵而提前死亡，并造成酸奶营养损失和酸度增加。保加利亚乳酸杆菌为酸奶发酵的常用菌种，最适生长温度为42-45℃。某研究小组欲验证室温长期保存会导致保加利亚乳酸杆菌死亡，从而造成酸奶品质下降。请完善下列实验方案。
（1）制备培养基：筛选保加利亚乳酸杆菌需使用_________培养基，其成分除了水、碳源、氮源和无机盐外，还应加入_______作为凝固剂。
（2）灭菌：对培养基进行灭菌的方法是_________，如需调节培养基的pH应在灭菌_______（前/后）进行。
（3）接种培养：将2-6℃和室温保存10天的酸奶分别用缓冲液稀释104、105、106倍，再使用______________法将稀释液接种到灭菌后的培养基上，放入_______（有氧/无氧）环境、42℃恒温箱中培养48小时，以利于其长出稳定菌落。此过程还需要设置________平板作为对照，目的是__________________。统计平板上呈现不规则圆形的灰白色菌落数。
（4）预期结果：________________________。
【答案】选择 琼脂 湿热灭菌（高压蒸汽灭菌） 前 稀释涂布平板 无氧 未接种酸奶稀释液的空白 排除培养基被杂菌污染 室温保存的酸奶实验组不规则圆形灰白色菌落的平均数少于2-6℃低温保存的对照组
【分析】
（1）培养基的营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。培养基的分类：①按物理性质分，分为液体培养基和固体培养基，固体培养基中含有凝固剂，一般是琼脂。②按化学成分分，分为天然培养基和合成培养。两者的区别是天然培养基成分不确定，合成培养基成分的含量是确定的。③按用途分，分为选择培养基和鉴别培养基。选择培养基主要是培养、分离特定的微生物，培养酵母菌可在培养基中加入青霉素；鉴别培养基可以鉴定不同的微生物，比如鉴别饮用水中是否含有大肠杆菌，可以用伊红-美蓝培养基，如果菌落呈深紫色，并带有金属光泽，说明有大肠杆菌。
（2）常用灭菌方法：灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌法。培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌和消毒方法依次：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌、化学消毒、紫外线灭菌、巴氏消毒法。
（3）接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。接种的目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在培养基表面形成单个细菌繁殖而成的子细胞群体--菌落。
【详解】
（1）筛选保加利亚乳酸杆菌需使用选择培养基，其成分除了水、碳源、氮源和无机盐外，还应加入琼脂作为凝固剂。
（2）采用湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）对培养基进行灭菌，如需调节培养基的pH应在灭菌前进行。
（3）将2-6℃和室温保存10天的酸奶分别用缓冲液稀释104、105、106倍，再使用稀释涂布平板法将稀释液接种到灭菌后的培养基上，乳酸杆菌进出无氧呼吸，产生乳酸，所以在培养放入无氧环境、42℃恒温箱中培养48小时，以利于其长出稳定菌落。此过程还需要设置未接种酸奶稀释液的空白平板作为对照，目的是排除培养基被杂菌污染。统计平板上呈现不规则圆形的灰白色菌落数。
（4）实验的目的是验证室温长期保存会导致保加利亚乳酸杆菌死亡，从而造成酸奶品质下降。实验培养设置的了常温培养和2-6℃培养，预期结果：室温保存的酸奶实验组不规则圆形灰白色菌落的平均数少于2-6℃低温保存的对照组。
【点睛】
本题的知识点是微生物培养过程，接种微生物的常用的接种方法，主要考生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。
60．经人工诱变后，部分细菌由于某种酶被破坏，其细胞中某些化学反应不能正常进行，就形成了营养缺陷型菌株，这在工业生产上有较广阔的应用前景。以下是实验人员利用影印法初检某种氨基酸缺陷型菌株的过程，请回答下列问题：
（1）微生物生长需要的营养物质有水、碳源和_______________等，除此之外，制备如图所示的培养基还需要加入__________________。
（2）培养基的灭菌方法一般为_______________。过程①的接种方法是__________________。
（3）根据用途分类，图中基本培养基属于________（填“选择”或“鉴别”）培养基。
（4）科研人员用放射线处理目的菌获得两个突变株C和D，然后对突变株C和D进行实验，结果如表所示。
接种的菌种
一般培养基
实验处理及结果
C
不生长
添加营养物质甲，能生长
D
不生长
添加营养物质乙，能生长
C＋D
能生长
不添加营养物质甲、乙，都能生长
突变株C不能在一般培养基上生长的原因最可能是___________________________。将突变株C和D混合在一起，接种于一般培养基上，都能生长的最可能的原因是________________________________________________________________________。
【答案】氮源、无机盐 凝固剂（或琼脂） 高压蒸汽灭菌法 稀释涂布平板法 选择 自身不能合成物质甲 突变株C 能合成物质乙，突变株D能合成物质甲，因此一起培养可以相互支持保证必须的营养要素
【分析】
分析题图，图中首先利用稀释涂布平板法分离细菌，然后运用“影印法”将菌种接种到两种培养基中：基本培养基、完全培养基，则在基本培养基中，氨基酸缺陷型菌株不能生长，而在完全培养基中能够生长，因此可以选择出氨基酸缺陷型菌株。
【详解】
（1）微生物的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，图示培养基上最后都长出了菌落，说明为固体培养基，因此制备培养基时需要加入凝固剂，常见的凝固剂是琼脂。
（2）培养基的灭菌的常用方法是高压蒸汽灭菌法。过程①导致菌落均匀分布，因此该方法为稀释涂布平板法。
（3）图示过程最终筛选出了氨基酸缺陷型菌株，说明图中基本培养基属于选择培养基.
（4）突变株C不能在一般培养基上生长的直接原因是自身不能合成物质甲．将突变株C和D混合在一起接种于一般培养基中，却能正常生长的最可能原因是突变株C能合成物质乙，突变株D能合成物质甲，因此一起培养可以相互支持保证必须的营养要素。
【点睛】
本题以图文结合的形式综合考查学生对微生物的实验室培养、微生物的分离与计数等相关知识的识记和理解能力。解答本题需熟记并理解相应的基础知识并形成清晰的知识网络。在此基础上，结合问题情境，从题图中提取有效信息进行相关问题的解答。
61．酸奶和泡菜的制作都离不开乳酸菌，某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料纯化乳酸菌。分离纯化所用的固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙从而产生溶钙圈。据此回答下列问题：
（1）下列生物的代谢类型和乳酸菌相同的是____（酵母菌，醋酸杆菌，破伤风杆菌，蓝藻），题目中分离纯化乳酸菌所用的培养基从功能角度判断属于__________培养基，分离纯化时应挑选出有______________的菌落作为候选菌。
（2）下图是用不同方法分离纯化乳酸菌得到的结果，A和B所用的接种方法分别是___________________和__________，两种方法都有将聚集的微生物进行稀释的操作，目的是_________________。如果要统计泡菜汁中乳酸菌的数目，应选择方法______________（A，B，A和B均可）。
（3）如果要对分离得到的乳酸菌进行保藏，对于频繁使用的菌种采用______________法，对于要长期保存的菌种采用 ________________法
【答案】破伤风杆菌 鉴别 溶钙圈 平板划线法 稀释涂布平板法 培养基表面形成由单个细胞繁殖而来菌落 B 临时保藏法 甘油管藏法
【分析】
1、酸奶和泡菜的制作原理：在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。2、接种微生物常用的两种方法：①平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。②稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
【详解】
（1）酵母菌是兼性厌氧型、醋酸杆菌是异养需氧型、破伤风杆菌是异养厌氧型、蓝藻是自养需氧型，乳酸菌是异养厌氧型。故代谢类型和乳酸菌相同的是破伤风杆菌。题目中分离纯化乳酸菌所用的培养基从功能角度判断属于鉴别培养基。分离纯化所用的固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙从而产生溶钙圈。故分离纯化时应挑选出有溶钙圈的菌落作为候选菌。
（2）据图可知，A所用的接种方法是平板划线法，B所用的接种方法是稀释涂布平板法，两种方法都有将聚集的微生物进行稀释的操作，目的是在培养基表面形成由单个细胞繁殖而来菌落。可用方法B来统计泡菜汁中乳酸菌的数目。
（3）如果要对分离得到的乳酸菌进行保藏，对于频繁使用的菌种采用临时保藏法，用试管固体斜面培养基培养乳酸菌，在4℃冰箱保藏；对于要长期保存的菌种采用 甘油管藏法，在-20℃冷冻箱中保存。
【点睛】
本题考查微生物的分离和培养及菌种的保藏，对于此类试题，需要考生注意的细节较多，如实验的原理、实验采用的方法、实验步骤等，需要考生在平时的学习过程中注意积累。
62．定水样是否符合饮用水卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌的数目。滤膜法的大致流程如图所示：用滤膜过滤待测水样→水样中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到EMB培养基上培养→统计菌落数目。请据图回答问题：
注：EMB培养基的成分：蛋白胨、NaCl、乳糖、水、X和琼脂
（1）EMB培养基中为细菌提供碳源的是___________，添加的X是__________，大肠杆菌在含有X的培养基表面长出的菌落呈黑色，从功能上看，EMB培养基属于________培养基。
（2）待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上的操作为：在无菌条件下，用___________冲洗滤杯，并再次过滤水样。
（3）取10mL待测水样加入90mL无菌水稀释，稀释后取10mL菌液通过滤膜法测得三个平板上的黑色菌落数分别为13、15、17，推测1L待测水样中的大肠杆菌数目为________个。
（4）在培养过程中，发现空白对照组的平板上检测到少许菌落，请分析最可能的原因是______________。
（5）如果在实验组的培养基上添加了青霉素再进行相同的操作，预测检测的大肠杆菌菌落数_______（填“会”或“不会”）变化，原因是______________。
【答案】蛋白胨和乳糖 伊红美蓝 鉴别 无菌水 1500 培养基灭菌不合格（不彻底）或培养过程被杂菌污染 会 青霉素会抑制细菌的生长
【分析】
滤膜法是检测水样中大肠杆菌群的方法。将一定量水样注入已灭菌的微孔薄膜的滤器中，经过抽滤，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴于伊红美蓝培养基（EMB培养基）上，经培养后计数和鉴定滤膜上生长的大肠杆菌菌落，依据过滤水样体积计算每升或每100毫升水样中的大肠杆菌菌群数。该方法操作简单、快速，主要适用于杂质较少的水样。
【详解】
（1）通过EMB培养基（伊红美蓝琼脂培养基）配方可知，EMB培养基中为细菌提供碳源的是蛋白胨和乳糖，添加的X是伊红美蓝，从功能上看，EMB培养基属于鉴别培养基。
（2）待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，可在无菌条件下，用无菌水冲洗滤杯，再次过滤，将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上，使实验测定结果更准确。
（3）无菌操作下将10ml 待测水样加入到90ml无菌水中，即稀释了10倍，稀释后的1mL菌液通过滤膜法测得EMB培养基上的菌落数平均为（13+15+17）÷3÷10=1.5个，黑色菌落为大肠杆菌，则推测1升待测水样中的大肠杆菌数目为1.5×1000=1500个。
（4）在培养过程中，发现空白对照组的平板上检测到少许菌落，可能是培养基灭菌不合格（不彻底）或培养过程被杂菌污染。
（5）如果在实验组的培养基上添加了青霉素再进行相同的操作，预测检测的大肠杆菌菌落数会变化，原因是青霉素会抑制细菌的生长。
【点睛】
本题以实验流程图为载体，考查了微生物的分离与计数的有关知识，要求考生能根据图示明确滤膜法的原理和步骤，掌握大肠杆菌的鉴定、分离与计数方法，结合题干信息准确答题。
63．苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据下图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：
（1）酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有_____。
（2）将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐_____，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步_____，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加_____。
（3）下图为连续划线法示意图，在图中_____（填图中序号）区域更易获得单菌落。在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上次划线的末端开始划线？_________。
（4）采用比色测定法（使用苯酚显色剂）检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5 号比色管的苯酚浓度应依次为_____。
管号
1
2
3
4
5
6
苯酚浓度/（mg·L-1）
1
如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21% 的苯酚残留，则需将残留液稀释_____（填序号：①5 ②10 ③20）倍后，再进行比色。
【答案】蛋白胨、苯酚 增加 稀释或稀释涂布 凝固剂或琼脂 ③ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少。每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而成的菌落。 0、0.2、0.4、0.6、0.8 ③
【分析】
稀释涂布平板法和平板划线法接种目的菌进行分离、纯化，前者主要应用于对目的菌进行计数，通过形成菌落来估算，后者仅仅是纯化菌种，但也需要挑选单菌落，所以二者都需要在固体培养基上完成培养。为了防止操作中、操作后造成杂菌污染，所以应注意每个环节中尽可能做到无菌操作，如对接种环的灼烧，在酒精灯的火焰旁进行接种环操作等等。
【详解】
（1）从培养基的成分来看，只有蛋白胨和苯酚内含有碳元素，其中可作为碳源的有蛋白胨、苯酚。
（2）因为最终要获得的菌株为可以高效降解酚的菌株，所以苯酚的用量应随转接次数增加而逐渐增加；稀释涂布平板法可以分离密集菌落，同时便于菌落的分离和计数，因此若上图平板中菌落过于密集，应进一步稀释或稀释涂布，以便于菌落计数与分离；平板培养基为固体培养基，在制备时除应加入的水及其他营养物质后，还需加入凝固剂（琼脂）。
（3）图示为平板划线法得到的平板，依据是每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，最后一次划线结束时更容易获得单菌落，因此图中③区域更易获得单菌落。平板划线法操作在作第二次以及其后的划线操作时，划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少。每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而成的菌落。
（4）题干中提到要制作系列浓度梯度进行显色反应，共配制了六支比色管，所以六支比色管的浓度值依次分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1；废水中含有50mg/L 苯酚溶液，降解后剩余21%，则剩余中含有50×21%=10.5mg/L 苯酚溶液，经过5倍或10倍稀释后分别为2.1mg/L 和1.05mg/L ，不在比色区间内，而20倍稀释后浓度为0.5mg/L ，在比色区间内，因此要稀释20倍后再进行比色。
故选③。
【点睛】
本题涉及用稀释涂布平板法和平板划线法接种目的菌进行分离、纯化和计数，关键是需要明确它们的操作方法和要求。如为什么需要对菌液进行稀释，为什么需要对接种环进行灼烧，为什么要用固体培养基等等。
营养缺陷型菌株就是在人工诱导（或自发突变）下，微生物细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏掉，使代谢过程中的某些合成反应不能进行，从而为工业生产积累大量的原料产物。以下是实验人员利用影印法初检氨基酸缺陷型菌株的过程，请回答。
64．过程①的方法为 _________________ ，与基本培养基（只含碳源、无机盐、水）相比，待测培养皿中特有的成分有______________________。
65．过程②应将印在丝绒布上的菌落先转印至____________培养基上，原因是___________________________________________________________________。 釆用影印法培养的优点是________________________________________ 。
66．为进一步完成对初检的缺陷型菌株的鉴定，实验人员进行了如下操作：
①用接种针挑取_____________（选填“菌落A”或“菌落B”）菌落接种于盛有完全培养液的离心管中，28℃震荡培养1—2天后，离心，取沉淀用 _____________洗涤菌体3次并制备成菌悬液。②吸取1mL菌悬液加入无菌培养皿中，倾注约15mL融化并冷却至45—50℃的基本琼脂培养基，冷凝后用记号笔在培养皿的皿底划分五个区域，做好标记。
③在划分的五个区域上放入少量分组的氨基酸结晶或粉末（五组混合氨基酸如下表所示），经培养后，观察生长圈出现的区域，从而确定属于何种氨基酸缺陷型。
组别
所含氨基酸
A
组氨酸
苏氨酸
谷氨酸
天冬酰胺
亮氨酸
B
精氨酸
苏氨酸
赖氨酸
甲硫氨酸
苯丙氨酸
C
酪氨酸
谷氨酸
赖氨酸
色氨酸
丙氨酸
D
甘氨酸
天冬氨酸
甲硫氨酸
组氨酸
丝氨酸
E
胱氨酸
亮氨酸
苯丙氨酸
丙氨酸
丝氨酸
在上述鉴定实验中，发现在培养基的A、D区域出现生长圈，则说明该缺陷型属于_________。
【答案】
64． 稀释涂布平板法 氨基酸
65． 基本 防止基本培养基中混入特殊的（氨基酸）营养成分 保证不同培养皿同种菌株的接种位置相同
66． 菌落A 无菌水 组氨酸缺陷型
【分析】
分析图可知：图中首先利用稀释涂布平板法分离细菌，然后运用“影印法”将菌种接种到两种培养基中：基本培养基、完全培养基，在基本培养基中，氨基酸缺陷型菌株不能生长，而在完全培养基中能够生长，因此可以选择出氨基酸缺陷型菌株。
64．
分析图解可知，过程①导致菌落均匀分布，因此该方法为稀释涂布平板法。两种培养基分别培养是为了筛选出氨基酸缺陷型菌株，因此与基本培养基（只含碳源、无机盐、水）相比，待测培养皿中特有的成分有氨基酸，类似于完全培养基。
65．
过程②应将印在丝绒布上的菌落先转印至基本培养基上，原因是防止基本培养基中混入特殊的（氨基酸）营养成分。采用影印法培养的优点是保证不同培养皿同种菌株的接种位置相同。
66．
①比较基本培养基（缺乏氨基酸）和完全培养基（含有氨基酸）中的菌落可知，菌落A为氨基酸缺陷型菌株（菌落更多），因此需要用接种针挑取菌落A接种于盛有完全培养液的离心管中，28°C震荡培养 1-2天后，离心，取沉淀用(无菌) 生理盐水洗涤菌体3次并制备成菌悬液。
③在划分的五个区域上放入少量分组的氨基酸结晶或粉末（五组混合氨基酸如下表所示），经培养后，观察生长圈出现的区域，根据题意可知，在培养基的A、D区域出现生长圈，说明A和D两种培养基中存在缺陷的氨基酸（因为加入了氨基酸，缺陷型菌株会生长，从而出现生长圈），与BCD组比较可知，AD组中的组氨酸是特有且相同的氨基酸，因此说明该缺陷型属于组氨酸缺陷型。
【点睛】
本题考查了微生物的分离与培养的有关知识，要求考生能够根据题干信息确定该菌种的筛选过程，同时能够根据表格信息确实能够缺陷的氨基酸种类，意在考查考生的信息处理能力。
67．苹果干腐病是由某种真菌感染引起的疾病，某植保人员设计实验研究了药物苦参碱和福美砷的抑菌效果。实验结果如下表所示，回答下列相关问题：
材料：经0．1%氯化汞消毒的9cm感染组织块
组别
无菌水
0．5%苦参碱
（植物源杀虫剂）
40%福美砷药液
（化学农药）
抑菌率（%）
PDA培养基培养配方：马铃薯、葡萄糖、链霉素、琼脂、蒸馏水
A
＋
－
－
0
B
－
＋
－
84.0
C
－
－
＋
82.6
注：＋表示加入，－表示不加。
（1）设置A组的作用是_________，PDA培养基是________（填物理状态）培养基，需采用_______法灭菌，推测PDA培养基中添加链霉素的目的是____________________________。
（2）本实验观测指标是：__________________________。
（3）根据实验结果，植保人员建议使用0．5%苦参碱防治苹果干腐病，建议的依据是①_________________；②_____________________。
【答案】对照 固体 高压蒸汽灭菌 抑制细菌生长，不影响真菌生长 培养基上的菌落数 0．5%苦参碱的抑菌效果与40%福美砷相当 苦参碱是植物源杀虫剂无残留不会污染环境，而福美砷是化学农药，长期使用会污染环境、影响人体健康
【分析】
培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；分为固体培养基和液体培养基，培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐，其中碳源和氮源常采用蛋白胨和牛肉膏，因为它们来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物种和氧气的要求。
【详解】
（1）本实验是研究药物苦参碱和福美砷的抑菌效果，A组没有加入药物苦参碱和福美砷，而是加入了等量的无菌水、目的是作为对照组。PDA培养基成分中含有琼脂，所以是固体培养基。培养基灭菌应用高压蒸汽灭菌。PDA培养基中添加链霉素的目的抑制细菌生长，但不影响真菌生长，可排除细菌对该实验的影响。
（2）该实验是研究药物苦参碱和福美砷的抑菌效果，若菌体生长被抑制，则培养基上的菌落数减少，所以本实验的观测指标是培养基上的菌落数。
（3）通过上述实验，植保人员建议使用0.5%苦参碱防治苹果干腐病。这是因为0.5%苦参碱的抑菌效果比40%福美砷略好，并且苦参碱是植物源杀虫剂、无残留、不会污染环境，而福美砷是化学农药，长期使用会污染环境、影响人体健康。
【点睛】
本题考查微生物的分离和培养，以苹果干腐病的防治为背景，考查了培养基的类型和无菌技术等知识，要求考生能够分析实验结构得出正确的实验结论。
68．酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。如图所示为操作流程，请回答下列问题：
（1）配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的___________，及时对培养基进行分装，并进行___________灭菌。
（2）取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约_________（在25℃，50℃或80℃中选择）的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后__________培养。
（3）挑取分离平板中长岀的单菌落，按步骤④所示进行划线。划线应注意的事项有__________________（答出两项即可）；步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和_________供应。
（4）研究人员从土壤样品中获得该类酵母后，若需要长期保存，可以采用______________的方法。
【答案】pH 高压蒸汽 50℃ 倒置 为保证无菌操作，接种环使用前都必须灭菌；每次划线结束后要进行灼烧；每一次在上一次划线结束处开始；划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落等 氧气 甘油管藏
【分析】
据图分析，①称量土样，里面含有需要分离的酵母菌；②表示梯度稀释，③④表示平板划线法，进行纯化培养；⑤表示扩大培养，获得更多的酵母菌。
【详解】
（1）配制培养基的操作步骤为称量→溶化→定容→调pH→分装→包扎→灭菌→倒平板，因此微生物的培养基配制好后应先调 pH，再分装。常见的灭菌方法有：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌。培养基适宜用高压蒸汽灭菌法灭菌。
（2）倒平板时需待培养基冷却到50℃左右时倒平板，冷凝后倒置培养，防止冷凝形成的水珠落入培养基后污染培养基。
（3）在划线过程中，接种针、接种环使用前必须灭菌，以防止杂菌污染培养基；每次划线结束后要进行灼烧，以清除接种环上残留菌种；每一次在上一次划线结束处开始，为了保证接种环上的酵母菌来自于上一次划线末端，通过增加划线次数使每一次划线时的酵母菌数目逐渐减少，最终得到由单个细胞繁殖而来的菌落；划线时应避免划破培养基表面，大量酵母菌聚集，不能形成正常菌落。酵母菌的代谢类型是兼性厌氧型，有氧呼吸可以产生大量能量供酵母菌大量繁殖，所以需提供足够的氧使酵母数量迅速增加。
（4）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
【点睛】
本题主要考查对食用菌菌种扩大培养并保存的过程中涉及的培养基配制、灭菌及菌种转移和保藏的一些基础知识，考生需注意归纳总结，才能减少犯错。
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