19 基因工程（讲义）——【高考二轮复习】2023年高考生物全面复习汇编（教师版+学生版）

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解密19 基因工程
考点热度 ★★★★★
内容索引
核心考点1 重组DNA技术的基本工具
基因工程定义
有关核酸的方向性问题
重组DNA技术的基本工具
DNA的粗提取与鉴定
核心考点2 基因工程的基本操作程序
转基因抗虫棉的主要四个步骤
相关的基本概念
PCR技术
探究·实践DNA片段的扩增及电泳鉴定
核心考点3 基因工程的应用
核心考点4 蛋白质工程
核心考点5 生物技术的安全性与伦理问题
转基因产品的安全性
关注生殖性克隆人
禁止生物武器
2022年高考题
2021年高考题

考点
由高考知核心知识点
预测
基因工程
（2022 浙江卷）29.农杆菌转化法
（2022 全国乙卷）12.PCR技术、蛋白质工程
（2022 山东卷）13.DNA的粗提取与鉴定
（2022 山东卷）25. 基因工程
（2022 北京卷）13. DNA的粗提取与鉴定
（2022 北京卷）21. 基因工程
（2022 广东卷）12. 基因工程
（2022 广东卷）22. 基因工程
（2022 海南卷）20. 基因工程
（2022 河北卷）24. 基因工程
（2022 湖南卷）22.基因工程、蛋白质工程
（2022 湖北卷）22. 基因工程
（2022 江苏卷）24. 基因工程
基因工程是选修教材中的重点考察内容之一，基因工程的基本操作程序、蛋白质工程的原理是重高频考点，山东卷北京卷兼顾了实验“DNA的粗提取与鉴定”。
（2021 湖北卷）7基因工程.
（2021 山东卷）4. 基因工程
（2021 山东卷）5. 基因工程
（2021 山东卷）13.DNA的粗提取与鉴定
（2021 天津卷）11、12.基因工程
（2021 全国卷 甲）12.基因工程
（2021 全国卷 乙）12.基因工程
（2021 浙江卷）29.细胞工程、基因工程
（2021 北京卷）16. 基因工程
（2021 广东卷）22.基因工程
（2021 海南卷）25.基因工程
（2021 河北卷）24. 基因工程
（2021 湖南卷）22.基因工程、细胞工程
（2021 辽宁卷）24. 基因工程
（2021 天津卷）16.基因工程


核心考点1 重组DNA技术的基本工具
基因工程：
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进
行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。

有关核酸的方向性问题：
① 核苷酸：
② 一条脱氧核苷酸链（DNA单链）:
1
2
3
4
5
1’碳连碱基
2’碳（脱氧核糖连无氧；核糖有氧）
3’碳连羟基（-OH）
5’碳连磷酸
⑥ tRNA的3’端结合氨基酸
⑦ 翻译时核糖体的移动方向：沿着mRNA的5’-3’方向移动
⑧ 限制性内切核酸酶识别的序列：沿5’-3’方向读取
Ø 一端的3’碳上有游离的羟基（-OH），叫3’端；
Ø 另一端的5’碳上有游离的磷酸基团，叫5’端。
Ø 一条核糖核苷酸链（RNA链）也是如此。
③ DNA是由两条脱氧核苷酸链，按反向平行的方式构成
④ DNA聚合酶：
总是从引物的3’端连接脱氧核苷酸（沿着模板链的5’-3’方向合成子链）
⑤ RNA聚合酶：
总是从引物的3’端连接核糖核苷酸（沿着模板链的5’-3’方向合成子链）



重组DNA技术的基本工具
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
DNA连接酶——“分子缝合针”
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”


限制性内切核酸酶——“分子手术刀”：
1、来源：
2、对原核生物的作用：
3、作用：
l 作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
l 结果：切割DNA成为两个DNA片段
识别的序列：
① 沿5’-3’方向读取
② 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数4个、8个。
③ 多数为回文序列
（因此，切割形成的黏性末端碱基序列：既相同，又互补）
黏性末端：
主要是原核生物
防止外来病原物的侵害,将外源DNA切割保证自身安全
当限制酶在它识别序列的中心轴线(图中虚线）两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；
黏性末端特点：既相同，又互补
当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
平末端：



DNA的粗提取与鉴定
一、原理
1、DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
2、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液
NaCl浓度
0.14 mol/L
DNA的溶解度
O
3、在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
二、过程
洋葱（30g）+研磨液（10mL）
研磨
取上清液
方法一：
方法二：
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
析出DNA
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA
取出DNA
方法一：
方法二：
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分
将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r/min的转速下离心5min，取沉淀物（弃上清液）
溶解DNA
2mol/L的NaCl溶液
鉴定DNA
实验组：
对照组：
2mol/L的NaCl溶液+DNA+二苯胺试剂4mL→沸水浴5min
2mol/L的NaCl溶液+二苯胺试剂4mL→沸水浴5min

核心考点2 基因工程的基本操作程序
转基因抗虫棉的主要四个步骤：


启动子：
终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。
启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。
诱导型启动子：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
终止子：
目的基因：
（如，Bt抗虫蛋白基因）位于启动子和终止子之间。
标记基因：
（如，抗生素抗性基因）将含有目的基因的细胞筛选出来
将目的基因导入受体细胞
导入植物细胞：
①花粉管通道法：
可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注人子房中；
可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
②农杆菌转化法：
导入动物细胞：
一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
显微注射法
利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中(图3-8)，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物
导入原核细胞：


目的基因的检测与鉴定
首先是分子水平的检测，包括：
其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定：
① 通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因
② 检测Bt基因是否转录出了mRNA；
③ 从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。
例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。

相关的基本概念：
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。（也可以是一些具有调控作用的因子）
目的基因：
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一
获取目的基因的有效方法：
PCR技术
扩增目的基因的方法：
引物：
定义：
①长度通常为20～30个核苷酸
②PCR需要2种引物
③有方向性
④G-C碱基对越多，复性温度越高，pcr反应越快。
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（复制一段DNA需要两种引物）
特点：
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
作用：
定义：


Bt抗虫蛋白基因（简称Bt基因）
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。

农杆菌转化法
① 可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
② 可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
1、转化：
是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。
随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。

2、农杆菌转化法的原理：
3、具体操作方法：


PCR技术
1、PCR：是聚合酶链式反应的缩写
DNA复制所需的基本条件：
2、PCR的原理：DNA半保留复制的原理
DNA母链——提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸——合成DNA子链的原料
DNA聚合酶——合成DNA子链的原料
解旋酶——（断开氢键）打开DNA双链
PCR所需的基本条件：
缓冲溶液：
耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
一般要添加Mg2+，DNA聚合酶都需要Mg2+激活
一般是含目的基因的DNA
DNA母链：
4种脱氧核苷酸：
四种脱氧核苷酸
（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）
引物：2种
控制温度

3、PCR过程：（在PCR扩增仪（PCR仪)中自动完成）
变性
复性
延伸
90℃以上：双链DNA解聚为单链
50℃左右：
72℃左右：
两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
溶液中的4种脱氧核苷酸（dNTP）在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
即：将4种脱氧核苷酸加到引物的3’端
5、常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
4、结果a*2n（a：初始数量；n：循环的次数）
30次左右


应用实例：
l 扩增某DNA片段：将引物设计在DNA片段的两端
l 定点突变：
l 从某一DNA上扩增其中的一部分：将引物设计在要扩增的DNA片段的两端
在引物的外侧（5’端）加上需要的序列（如，限制酶切割位点，特定的启动子等）


图中的酶a、酶b分别是限制酶酶a、酶b的识别序列




探究·实践DNA片段的扩增及电泳鉴定

PCR原理：（DNA半保留复制原理）
利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
琼脂糖凝胶电泳原理：
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
方法步骤：（略）

注意
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。


核心考点3 基因工程的应用
基因工程在农业方面的的应用
转基因生物
目的基因
优点
转基因抗虫植物
Bt抗虫蛋白基因
减少虫害、减少农药污染
转基因抗病植物
某些病毒、真菌等的抗病基因
减少病害、减少农药污染
转基因抗除草剂植物
降解或抵抗某种除草剂的基因（如，抗草甘膦基因）
抗除草剂、提高农田管理效率
改良植物的的品质
必需氨基酸多的蛋白质编码基因；植物花青素代谢有关的的基因
提高玉米的营养价值；改良花卉
提高动物的生长速度
外源生长激素基因
提高鲤鱼的生长速率
改善畜产品的品质
肠乳糖酶基因
使转基因奶牛的乳汁中减少乳糖含量，以利于乳糖不耐受的人食用牛奶。

基因工程在医药卫生领域的应用
生产基因工程药品
利用转基因微生物
利用大肠杆菌或酵母菌生产干扰素
利用转基因动物
将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子重组在一起，培育转基因克隆动物作为乳腺（乳房）生物反应器，生产医用蛋白
利用转基因植物

器官移植
转基因克隆猪作为器官移植的的来源，可以避免免疫排斥反应
在猪的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达

用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。
基因工程菌：
基因工程在食品工业方面的应用
淀粉酶、脂酶等：
l 大多数奶酪的生产需要使用凝乳酶来凝聚固化奶中的蛋白质。
l 将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶
通过构建基因工程菌，然后用发酵技术大量生产。
降解多种污染物的“超级细菌”，也是通过基因工程生产的


核心考点4 蛋白质工程



蛋白质工程的基本原理
由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。
从预期的蛋白质功能出发
设计预期的蛋白质结构
推测应有的氨基酸序列
找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因
获得所需要的蛋白质
蛋白质工程的基本思路：
蛋白质工程的应用

问题、解决方法
实现途径
速效胰岛素
问题：
天然胰岛素制剂容易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。
解决方法：
B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与B29位的赖氨酸交换位置
改造胰岛素基因：
使编码胰岛素B链第28位脯氨酸的碱基序列替换成编码天冬氨酸序列或重新编码B链28、 29位氨基酸的序列使之成为赖氨酸、脯氨酸
干扰素
问题：
干扰素在体外保存相当困难
解决方法：
将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸
改造干扰素基因
小鼠单克隆抗体
问题：
会使人产生免疫反应，从而导致它的治疗效果大大降低
解决方法：
将小鼠抗体上结合抗原的区域“嫁接”到人的抗体上
改造抗体基因



核心考点5 生物技术的安全性与伦理问题
转基因产品的安全性


相关的法规：
《农业转基因生物安全管理条例》
《农业转基因生物安全评价管理办法》
《农业转基因生物进口安全管理办法》
《农业转基因生物标识管理办法》
《农业转基因生物加工审批办法》
《进出境转基因产品检验检疫管理办法》

关注生殖性克隆人
生殖性克隆人面临的伦理问题
l 生殖性克隆：是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。
l 治疗性克隆：
是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。
大多数人对生殖性克隆人的研究持否定态度：
生殖性克隆人是在人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人，严重地违反了人类伦理道德，是克隆技术的滥用。
克隆技术还不成熟：
生殖性克隆人会面临些问题：流产、死胎和畸形儿等，这显然与人类传统的伦理道德是背道而驰的。

我国禁止生殖性克隆人
l 我国政府一再重申四不原则：
不赞成
不允许
不支持
不接受
任何生殖性克隆人实验
原因如下：
①克隆人只是某些人出于某种目的制造出的“产品”，没有“父母”，这可能导致他们在心理上受到伤害；
②由于技术问题，可能孕育出有严重生理缺陷的克隆人；
③克隆人的家庭地位难以认定，这可能使以血缘为纽带的父子、兄弟和姐妹等人伦关系消亡；
④生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念；
⑤生殖性克隆人是对人类尊严的侵犯；
⑥生殖性克隆人破坏了人类基因多样性的天然属性，不利于人类的生存和进化。

l 我国的相关法规：
《人类辅助生殖技术管理办法》
《人类辅助生殖技术规范》
《人类辅助生殖技术和人类精子库伦理原则》
《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》
《干细胞临床研究管理办法（试行）》
例如：《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》规定：利用体外受精、体细胞核移植等技术获得的囊胚，其体外培养期限自受精或核移植开始不得超过14d；不得将这样获得的已用于研究的人囊胚植入人或任何其他动物的生殖系统。

禁止生物武器


生物安全：
生物安全是指与生物有关的各种因素对社会、经济、人类健康以及生态环境所产生的危害或潜在风险。消除生物武器威胁、防止生物武器扩散是生物安全防控的重要方面。
前事不忘，后事之师
l 侵华日军
侵华日军组建了从事细菌战的731部队和100部队，并在我国领土上修建了几十座细菌武器工厂，大量培养鼠疫、霍乱、伤寒和炭疽等一系列致命的传染性疾病的病原体。为了检验生产出来的细菌武器的效能，侵华日军曾用数千名中国人做实验。他们还曾在我国20多个地区使用了细菌武器，造成几十万老百姓死亡。
1950年12月至1951年1月，在中国人民志愿军的打击下，美军从“三八线”南撤。在此过程中，他们散布了大量的天花病毒，使约3500人患上天花，约350人死亡。1952年初，美军又在志愿军控制区投下了细菌弹，散布了大量苍蝇、跳蚤等昆虫。经我国军事医学专家鉴定、这些昆虫带有可引起鼠疫、霍乱、伤寒、痢疾、脑膜炎和回归热等疾病的10多种致病菌。随后，美军又将细菌战扩大到我国东北的抚顺、安东、凤城、宽甸和临江等地。
l 美国军队


对生物武器的威胁，不能掉以轻心
l 1978年，天花就已经在地球上消失，但是某些国家至今仍然保存着天花病毒毒株。
l 有报道称，有的国家已经研制出新型的鼠痘病毒，
l 在实验室里，有人通过转基因技术把蜡状杆菌改造成像炭疽杆菌一样的致病菌；有人将生物毒素分基因与流感病毒的基因拼接在一起，然后再用基因工程的方法进行批量生产；
l 也有人对流感病毒基因进行改造，以使具有某种易感基因的民族感染上这种病毒，而施放国的人却不易感染。
l 威胁：
l 应对措施：
1972年4月，苏联、美国、英国分别在其首都签署了《禁止试制、生产和储存并销毁细菌（生物）和毒剂武器公约》(简称《禁止生物武器公约》)，该公约于1975年3月生效。1984年11月，我国也加入了这一公约。
1998年6月，中美两国元首在关于《禁止生物武器公约》议定书的联合声明中，重申了在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。




2022年高考题
29. 回答下列（一）、（二）小题：（二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：
（4）在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制___________生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度___________时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的___________检测。
（5）为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的___________能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内___________形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的___________，分析染色体组型是否改变进行判断。
（6）植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和___________长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为___________时全能性表达能力最高。
（2022 全国乙卷）12. 新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
（1）新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是______，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
（2）为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的______来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______。
（3）某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明______（答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明______。
（4）常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是______。
（2022 山东卷）13. 关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）
A. 过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B. 离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C. 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D. 粗提取的DNA中可能含有蛋白质
（2022 山东卷）25. 某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
（1）为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_______、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______（填“3'端”或“5'端”）。
（2）PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是______。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是______。

（3）融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是______；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______。

（4）根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是______。
（2022 北京卷）13. 下列高中生物学实验中，对实验结果不要求精确定量的是（　　）
A. 探究光照强度对光合作用强度的影响
B. DNA的粗提取与鉴定
C. 探索生长素类调节剂促进插条生根的最适浓度
D. 模拟生物体维持pH的稳定
（2022 北京卷）21. 生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。
（1）将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是_______。
（2）为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是_______，因而被用于制备监测鱼（MO）。

（3）现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子：____。
①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌）
Ⅱ.基因：______
A．GFP B.Gal4 C.雌激素受体基因（ER） D.仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）
（4）SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后_______造成不育。
（5）使拟用于实际监测的SM不育的目的是_______。
（2022 广东卷）12. λ噬菌体的线性双链DNA两端各有一段单链序列。这种噬菌体在侵染大肠杆菌后其DNA会自连环化（如图），该线性分子两端能够相连的主要原因是（ ）

A. 单链序列脱氧核苷酸数量相等
B. 分子骨架同为脱氧核糖与磷酸
C. 单链序列的碱基能够互补配对
D. 自连环化后两条单链方向相同
（2022 广东卷）22. “绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。

回答下列问题：
（1）研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对________________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
（2）研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是________________，终止子的作用是________________。
（3）培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
（4）这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
（2022 海南卷）20. 以我国科学家为主的科研团队将OSNL（即4个基因Oct4／Sox2／Nanog／Lin28A的缩写）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（CEFs），诱导其重编程为诱导多能干细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs），然后将iPGCs注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。

（1）CEFs是从孵化9天的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用___________________________处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加______________等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。
（2）体外获取OSNL的方法有______________（答出1种即可）。若要在CEFs中表达外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和______________等。启动子是______________识别和结合的部位，有了它才能驱动____________________________。
（3）iPS细胞和iPGCs细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是______________。
（4）诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是__________。
（5）该实验流程中用到的生物技术有________________（答出2点即可）。
（2022 河北卷）24. 蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题：
（1）蛋白酶抑制剂的抗虫机制是________。
（2）________是实施基因工程的核心。
（3）利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的________上，此方法的不足之处是________。
（4）为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有________（写出两点即可）。
（5）确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的________以鉴定其抗性程度。下图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析________（填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是________。

（6）基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生________。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是________（写出两点即可）。
（2022 湖南卷）22. 水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
（1）蛋白质工程流程如图所示，物质a是_______，物质b是_______。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_______________________。

（2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有___________、__________和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是____________________。
（3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的______（填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是______________________________。

（4）若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路________________________________________。
（2022 湖北卷）22. “端稳中国碗，装满中国粮”，为了育好中国种，科研人员在杂交育种与基因工程育种等领域开展了大量的研究。二倍体作物M的品系甲有抗虫、高产等多种优良性状，但甜度不高。为了改良品系甲，增加其甜度，育种工作者做了如下实验；
【实验一】遗传特性及杂交育种的研究
在种质资源库中选取乙、丙两个高甜度的品系，用三个纯合品系进行杂交实验，结果如下表。
杂交组合
F1表现型
F2表现型
甲×乙
不甜
1/4甜、3/4不甜
甲×丙
甜
3/4甜，1/4不甜
乙×丙
甜
13/16甜、3/16不甜
【实验二】甜度相关基因的筛选
通过对甲、乙、丙三个品系转录的mRNA分析，发现基因S与作物M的甜度相关。
【实验三】转S基因新品系的培育
提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培有出转S基因的新品系。
根据研究组的实验研究，回答下列问题：
（1）假设不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，则乙、丙杂交的F2中表现为甜的植株基因型有_____种。品系乙基因型为_______。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中甜∶不甜比例为_____。
（2）下图中，能解释（1）中杂交实验结果的代谢途径有___________。

（3）如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用_____________酶切割S基因的cDNA和载体。

（4）用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，其目的是________。
（5）除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方法还有___________（答出2点即可）。
（2022 江苏卷）24. 纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
（1）纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是__________________。

（2）某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0mo1/L的目的是__________________。PCR扩增时，需在__________________催化下，在引物__________________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
（3）为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。

分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向）
①选择图Ⅱ引物_____________；
②PCR目的产物约为_____________bp。
确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是____________（选填序列编号）
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明________________________。

（4）为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经_____________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的_____________倍。




2021年高考题
（2021 湖北卷）7. 限制性内切酶EcoRI识别并切割双链DNA，用EcoRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（ ）
A. 6 B. 250 C. 4000 D. 24000
（2021 山东卷）4. 我国考古学家利用现代人的 DNA 序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”，成功将极其微量的古人类 DNA 从提取自土壤沉积物中的多种生物的 DNA 中识别并分离出来，用于研究人类起源及进化。下列说法正确的是（ ）
A. “引子”的彻底水解产物有两种
B. 设计“引子”的 DNA 序列信息只能来自核 DNA
C. 设计“引子”前不需要知道古人类的 DNA 序列
D. 土壤沉积物中的古人类双链 DNA 可直接与“引子”结合从而被识别
（2021 山东卷）5. 利用农杆菌转化法，将含有基因修饰系统的 T-DNA 插入到水稻细胞 M 的某条染色体上，在该修饰系统的作用下，一个 DNA 分子单链上的一个 C 脱去氨基变为 U，脱氨基过程在细胞 M 中只发生一次。将细胞 M 培育成植株 N。下列说法错误的是（ ）
A. N 的每一个细胞中都含有 T-DNA
B. N 自交，子一代中含 T-DNA 的植株占 3/4
C. M 经 n（n≥1）次有丝分裂后，脱氨基位点为 A-U 的细胞占 1/2n
D. M 经 3 次有丝分裂后，含T-DNA 且脱氨基位点为 A-T 的细胞占 1/2
（2021 山东卷）13. 粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（ ）
A. 加入适量的木瓜蛋白酶
B. 37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟
C. 加入与滤液体积相等、体积分数为 95%的冷却的酒精
D. 加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L
阅读下列材料，完成下面小题。
为提高转基因抗虫棉的抗虫持久性，可采取如下措施：
①基因策略：包括提高杀虫基因的表达量、向棉花中转入多种杀虫基因等。例如，早期种植的抗虫棉只转入了一种Bt毒蛋白基因，抗虫机制比较单一；现在经常将两种或两种以上Bt基同时转入棉花。
②田间策略：主要是为棉铃虫提供底护所。例如我国新疆棉区，在转基因棉田周围种植一定面积的非转基因棉花，为棉铃虫提供专门的庇护所：长江、黄河流域棉区多采用将转基因抗虫棉与高粱和玉米等其他棉铃虫寄主作物混作的方式，为棉铃虫提供天然的庇护所。
③国家宏观调控政策：如实施分区种植管理等。
11. 关于上述基因策略，下列叙述错误的是（ ）
A. 提高Bt基因的表达量，可降低抗虫棉种植区的棉铃虫种群密度
B. 转入棉花植株的两种Bt基因的遗传不一定遵循基因的自由组合定律
C. 若两种Bt基因插入同一个T-DNA并转入棉花植株，则两种基因互为等位基因
D. 转入多种Bt基因能提高抗虫持久性，是因为棉铃虫基因突变频率低且不定向
12. 关于上述田间策略，下列叙述错误的是（ ）
A. 转基因棉田周围种植非抗虫棉，可降低棉铃虫抗性基因的突变率
B. 混作提高抗虫棉的抗虫持久性，体现了物种多样性的重要价值
C. 为棉铃虫提供底护所，可使敏感棉铃虫在种群中维持一定比例
D. 为棉铃虫提供庇护所，可使棉铃虫种群抗性基因频率增速放缓
（2021 北京卷）12. PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是_________。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是_______ 。
（3）为了做出正确诊断，PCR反应所用的引物应该能与_______ 特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指_______。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
12. 用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。

回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E. coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中__________酶切割后的DNA片段可以用E. coli DNA连接酶连接。上图中___________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能___________；质粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指__________________。
（2021 浙江卷）29.（二）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。
（1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体__________，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。
（2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体形成_______，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克隆，质粒载体应含有__________（答出2点即可）。提取质粒后，采用____法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
（3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用__________分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行__________培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为__________，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
（2021 北京卷）16. 新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐，接种疫苗是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多种，其中我国科学家已研发出的腺病毒载体重组新冠病毒疫苗（重组疫苗）是一种基因工程疫苗，其基本制备步骤是：将新冠病毒的S基因连接到位于载体上的腺病毒基因组DNA中，重组载体经扩增后转入特定动物细胞，进而获得重组腺病毒并制成疫苗。
（1）新冠病毒是RNA病毒，一般先通过_______得到cDNA，经_______获取S基因，酶切后再连接到载体。
（2）重组疫苗中的S基因应编码________。
A. 病毒与细胞识别的蛋白 B. 与病毒核酸结合的蛋白
C. 催化病毒核酸复制的酶 D. 帮助病毒组装的蛋白
（3）为保证安全性，制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因，使其在人体中无法增殖，但重组疫苗仍然可以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答。该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→________→_________→诱发特异性免疫反应。
（4）重组疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其DNA不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因________。
（2021 广东卷）22. 非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。

回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有___________。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有___________。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备___________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有___________。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是___________。在分子水平上，可以通过改变___________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
（2021 海南卷）25. CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。

回答下列问题。
（1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是____________。
（2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是____________。
（3）过程③~⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是____________。随后，Cas9蛋白可切割____________序列。
（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是____________，基因敲除成功的判断依据是____________。
（5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：________________________。
（2021 河北卷）24.采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为__________。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是__________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是______________________________。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是__________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是______________________________。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的__________（填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的__________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。

（5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是____________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于___________（写出两点即可）。
（2021 湖南卷）22. M 基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M 基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题：

（1）在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是_________，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的_________断开。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是_________。
（3）与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是_________。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为_________（答出两点即可），功能上具有_________。
（4）鉴定转基因动物：以免疫小鼠的_________淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路_________。
（2021 辽宁卷）24. PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
（1）为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经__________过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
（2）图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入__________和__________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用__________（填“E．coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。

相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcoRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
（3）转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于__________的生理状态，以提高转化效率。
（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。

注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中
（5）将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的__________（填“G1”或“S”或“G2/M”）期。

（2021 天津卷）16. 乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。


（1）乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为___________。
（2）获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑___________和___________。
②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有____________，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列___________（能/不能）在大肠杆菌中高效表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在___________的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
（3）以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。
A. 进一步优化发酵条件 B. 使用乳酸菌LDH基因自身的启动子
C. 敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D. 对转基因酿酒酵母进行诱变育种