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专题15 微生物的培养与利用-备战 高考生物二轮复习题型专练
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专题15 微生物的培养与利用【要点提炼】 【方法指导】课题一 微生物的实验室培养·培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。·培养基按照物理性质可分为液体培养基 半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。液体培养基应用于工业或生活生产，固体培养基应用于微生物的分离和鉴定，半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。·按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。[来源:学科网]·按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。·培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 、生长因子等。·碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。·氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。·培养基还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件·无菌技术·获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。[来源:学科网ZXXK]③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。·消毒与灭菌的区别消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。灭菌方法： ①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法； ②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ； ③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。 ④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。制作牛肉膏蛋白胨固体培养基（1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。（2）倒平板操作的步骤：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。④等待平板冷却凝固，大约需5～10min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。·倒平板操作的讨论1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。纯化大肠杆菌（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。（5）平板划线法操作步骤：①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。③将试管口通过火焰。④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。⑧将平板倒置放入培养箱中培养。·平板划线操作的讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。（6）涂布平板操作的步骤：①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。②取少量菌液，滴加到培养基表面。③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s。④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布平板操作的讨论涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。菌种的保存（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。①临时保藏方法将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。疑难解答（1）生物的营养营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物质。[来源:学§科§网Z§X§X§K]人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。（2）确定培养基制作是否合格的方法将未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数尿素是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶。尿素最初是从人的尿液中发现的 筛选菌株（1）实验室中微生物的筛选应用的原理人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。（2）选择性培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数2.为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC 3.本法仅限于形成菌落的微生物设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。实验设计实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。（1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。（2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30到300之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用104 105 106测定放线菌的数量，一般选用103 104 105[来源:学科网ZXXK] 测定真菌的数量，一般选用102 103 104（3）微生物的培养与观察[来源:学#科#网Z#X#X#K]不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌30~37℃ 1~2天放线菌25~28℃ 5~7天 霉菌25~28℃ 3~4天每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、唯独及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。形状、大小、隆起程度、颜色。疑难解答（1）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值每克样品中的菌落数=（C/V）*M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数课题三 分解纤维素的微生物的分离纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。纤维素与纤维素酶（1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。（2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。纤维素分解菌的筛选（1）筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。分离分解纤维素的微生物的实验流程土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落（1）土壤采集 选择富含纤维素的环境。（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤 倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板（3）刚果红染色法种类一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。课题延伸对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后，只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。疑难解答（1）为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。（2）将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。（3）两种刚果红染色法的比较方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。（4）为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。【专题训练】1．下列有关细菌纯培养的说法，不正确的是 ( )A．实验操作者接种前需用70%的酒精棉球擦手消毒B．每次划线后接种环要在酒精灯火焰上灼烧灭菌C．培养基上的单个菌落都是一个细菌细胞的克隆D．菌液梯度稀释后用涂布法接种，得到单菌落便于计数2．某研究小组欲研究被石油污染过的土壤中细菌的数量，并从中筛选出能分解石油的细菌。下列操作错误的是( )A．称取和稀释被污染的土壤时应在火焰旁B．用以石油为唯一碳源的培养基进行筛选C．分离菌种时可采用稀释涂布平板法接种 D．对细菌进行计数时宜采用平板划线法接种3．如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为12345，下列说法中正确的是( )A．操作前要将接种环用酒精消毒 B．划线操作须在火焰上方进行C．只有在5区才可以得到所需菌落 D．在12345区域中划线前后都要对接种环灭菌4．在鉴别纤维素分解菌的培养基中，常常加入水溶性的羧甲基纤维素钠(CMC－Na)。下列叙述错误的是( )A．羧甲基纤维素钠(CMC－Na)主要为细菌提供氮源B．刚果红染液能与培养基中的纤维素形成红色复合物C．刚果红可在倒平板时加入，加入前需要将刚果红溶液灭菌D．纤维素酶至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶5．关于灭菌和消毒不正确的理解是( )A．灭菌是指杀灭环境中一切微生物的细胞、芽孢和孢子B．消毒和灭菌实质是相同的C．接种环用灼烧法灭菌 D．常用的消毒方法有加热法、过滤法、紫外线法、化学药品法6．牛奶中富含蛋白质，长期饮用有助于增强体质，但牛奶同时也是多种疾病的传播载体。国家标准是每毫升牛奶中细菌数小于30 000个。以下是牛奶消毒及细菌检测实验。分析回答：(1)图中步骤①称为____________消毒法。步骤②是_________。(2)培养基中的蛋白胨可以为微生物提供____________。进行步骤③操作时，应选用下列中的哪种工具？______________。为了避免杂菌污染，此步骤应在__________________附近进行。(3)将接种后的培养基和作为对照的________________同时放入37 ℃恒温培养箱中，培养36 h。取出后统计各平板的菌落数，结果如下表所示。应该选择其中稀释倍数为________________的平板进行计数，经过消毒后的牛奶中，细菌数大约是________个·mL－1。7．表格是某公司研发的一种培养大肠杆菌的培养基配方，请结合所学知识，回答下列相关问题。(1)根据用途划分，该培养基属于________培养基，若要分离能分解尿素的细菌，需对培养基做出的最关键的调整是____________，若还需鉴定分解尿素的细菌，需做出的调整是________________。(2)从培养基的成分上看，大肠杆菌的同化类型为________。该培养基能否分离筛选出大肠杆菌？为什么？___________________________________________________________。(3)在实验室培养微生物时，获得纯净培养物的关键是_______，紫外线可对空气进行灭菌的原因是_______________________________________________________________。(4)某同学尝试纯化大肠杆菌，其中一个平板的菌落分布如上图，推测该同学接种时可能的操作失误是___________________________________________________________。8．土壤中的苯酸(C6H5OH)对环境有极大的污染，实验室希望能从土壤中分离出能专一性降解苯酚的微生物，下图是部分实验过程。回答下列问题：(1)为了分离纯化目的菌种，①～④步骤的培养基中都加入了一定浓度的苯酚，该物质能为微生物提供________，除此而外，培养基中一般都还需要水、__________等营养物质。(2)制备步骤④所需要的固体培养基，操作顺序是：计算→称量→________→________→倒平板。为了在步骤⑤的平板上形成单个的菌落，涂布平板前，需要对培养液进行多次稀释，原因是_____________________________________________。(3)研究人员想通过比较试管甲和乙中微生物的生长情况，来证明分离出来的微生物只能以苯酚作为碳源，若甲试管中的液体培养基中的唯一碳源是苯酸，那么，乙试管中培养基成分与甲相比，区别是______________。研究人员对甲、乙两支试管进行接种时，所选菌种都来自步骤⑤平板上的同一个单菌落，这样做的目的是_______________________________。9．不同品牌的酸奶具有不同的口味。某研究小组利用含碳酸钙的固体培养基探究甲、乙两品牌酸奶中乳酸菌的类型是否相同(乳酸能够溶解碳酸钙，使培养基变得透明)。请回答下列问题：(1)将甲、乙两品牌酸奶中的乳酸菌纯化，分别接种在含碳酸钙的固体培养基中培养，根据菌落周围透明圈的大小，可确定酸奶中乳酸菌的类型。不同乳酸菌菌落透明圈大小不同的原因是________________________________________________________________________________________________________________________。(2)家庭制作酸奶时，在纯牛奶中加入少量酸奶相当于微生物培养技术中的________操作。纯牛奶变成酸奶，改变了口味但含有的能量减少，原因是_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)为长期保存纯化的优质乳酸菌，可将菌液与________充分混匀，置于20 ℃的冷冻箱中保存。(4)该研究小组进一步探究甲品牌酸奶中乳酸菌数量，实验操作如下图。接种微生物的方法有很多，图中过程①②③所示的方法为________。用该方法统计样本菌落数后，所得数据需要乘以10n后，才可表示乳酸菌的数量(单位：个/mL)，这里的n＝________。用该方法统计样本菌落数时，同时需要做A、B、C三个平板，目的是____________________________。如果平板菌落数超过300，一般还需进一步________。10．某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是_________________________________。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是__________________________(答出两点即可)。(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是________________。(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________________________(答出两点即可)。11．对硝基苯酚(PNP)颜色为黄色，若被分解则颜色消失，属于硝基苯酚类有机化合物的一种，主要来源于农药、医药、染料、塑料等生产企业排放，并广泛分布于环境中，对植物、微生物和动物均有毒性。某生物兴趣小组提出从污水厂曝气池长期驯化的污泥中分离出对硝基苯酚降解菌并研究其降解特性。回答下列问题：(1)分离对硝基苯酚降解菌的选择培养基成分有：NH4NO3、KH2PO4、K2HPO4、NaCl、FeSO4、MgSO4·7H2O、PNP和琼脂。试从成分分析该选择培养基能起到筛选作用的原因是__________________________________________________________________。(2)利用________(方法)分离纯化得到单一的对硝基苯酚降解菌菌落，可以将在菌落周围是否产生________作为筛选标记。(3)若分离纯化后得到了两个菌落，这两个菌落的形态、大小、光泽度、颜色等________(填“一定”或“不一定”)相同。(4)研究不同的糖类对PNP降解率的影响，得到的结果如表所示：从表中可得出的结论是___________________________________________________。12．凝乳酶是干酪和干酪素生产过程中的关键酶，动植物及微生物均能产生。由于微生物资源丰富，生长周期短，受气候等因素限制小等特点，微生物凝乳酶成为研究热点。为获得凝乳酶高产菌株，科研人员进行了以下分离、筛选、鉴定工作。培养基配方表：(1)从作用上看，该培养基属于________________(填“选择”或“鉴别”)培养基。(2)科研人员将牧区采集的土壤样品放入无菌水中，振荡混匀，制成悬液。为获得较均匀分布的单菌落，还需要将悬液进行________，用______法接种于上述培养基上。接种后的培养基以__________状态放入培养箱。(3)在涂布接种前，科研人员随机取若干灭菌后的空白平板先进行培养了一段时间，这样做的目的是________________________________________________________________________________。(4)在稀释倍数为106倍下涂布了三个平板(每次取0.1 mL)，统计菌落数分别为240、250、260，则稀释前1 mL菌液中所含此菌数量为________________。(5)挑选菌落时以白色沉淀圈大且透明圈小者为佳。将获得的菌株进行液体培养后，从培养液的________(填“上清液”或“沉淀物”)获得粗提的凝乳酶。将一定量的粗提凝乳酶与适量酪蛋白溶液混合，一定时间后测定吸光值来测定酶活性。进行吸光值测定值，需将________与等量酪蛋白溶液混合，作为实验的对照。13．某生物兴趣小组探究不同C/N的比值对谷氨酸棒状杆菌的数量和产物产生的影响，记录及其结果如下表。回答下列问题：(1)该兴趣小组进行实验时所用培养基除了能为谷氨酸棒状杆菌提供碳源和氮源外，还能提供的主要营养物质是________。(2)统计待测培养液中谷氨酸棒状杆菌的数量，可采用的方法有显微镜直接计数法和稀释涂布平板法。①利用显微镜直接计数法统计过程：取第二组的100倍的稀释液0.1 mL滴加到计数板(由25×16＝400个小室组成，容纳液体总体积为0.1 mm3)在计数室内共有菌体48个，则1 mL的第二组发酵液中有菌体________个。用该方法测定的微生物数量大于实际的活菌数，原因是__________________________________________________________________。②利用稀释涂布平板法统计的结果比实际值往往________(填“偏大”或“偏小”)，原因是_____________________________________________________。(3)根据表中信息可知，培养过程中需先将碳氮比设为4∶1，目的是________________________，然后将发酵液中碳氮比改为3∶1继续培养，目的是_____________________________________________________。14．回答下列与酵母菌有关的问题：(1)分离培养酵母菌通常使用____________(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基，该培养基应采用________灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后会观察到菌落，菌落的含义是______________。(2)酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进______________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)；若进行厌氧培养，可促进________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)。(3)制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是______________________。15．手机高温、潮湿的环境非常适合细菌的生长，由大肠杆菌引起的食源性疾病日渐成为社会比较关注的公共卫生问题。为了了解手机上大肠杆菌的种类及分布情况，某兴趣小组进行了如下实验步骤。请进一步完善实验内容并回答相关问题：(1)实验步骤：①配制含有________、水、无机盐的固体培养基，并在培养基中加入少量________(使大肠杆菌菌落呈现黑色)；②从10名学生的手机正、反面采集样品，分别接种至灭菌的培养基上，在37℃恒温培养箱中培养24～48h，选取________的菌落；③将接种针用________法灭菌后，将②中选取的菌落接种到________(填“固体”或“液体”)培养基，在恒温摇床上培养24h，使细菌大量繁殖；④用________法将③过程所获得的细菌接种到培养基上，分别统计菌落的种类和数目；⑤根据菌落的特征进一步鉴定大肠杆菌的类型。(2)上述实验步骤中，从用途看，①所用培养基属于________培养基。(3)上述实验步骤④统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是__________________________________。16．某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生______________________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是____________________________。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________________________________(答出两点即可)。(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是____________________________________。(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________(答出两点即可)。17．在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________。(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________，在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是____________________________。18．北方每年在小麦丰收的季节，焚烧秸秆火焰四起，烟雾弥漫，不但导致严重的雾霾而且造成资源的浪费。科学家为了解决这个问题，努力寻找分解秸秆中纤维素的微生物，他们做了如下实验，据图回答：eq \x(\a\al(从森林,里取土,壤样本))―→eq \x(\a\al(选择,培养))―→eq \x(\a\al(梯度,稀释))―→eq \x(\a\al(将样品接种到,鉴别纤维素分,解菌的培养基,上))―→eq \x(\a\al(挑选产生透明圈,的菌落，统计并,计算每克样品中,的细菌数)) 甲图(1)根据甲图，选择培养纤维素分解菌要用______________。为了鉴别纤维素分解菌，常在培养基中加入________。为了统计样品中活菌的数目，常用方法除稀释涂布平板法外，还有____________的方法。(2)乙图是培养出的单菌落示意图，最适合分解秸秆的两个菌落是______________(填数字)，纤维素分解菌将纤维素最终分解为________________。从图中可以看出培养基上菌落数较少，推测可能的原因是______________________________。(3)为了长期保存该微生物，可以采用________________的方法。19．如表为某微生物培养基的配方，请回答下列问题：(1)依物理性质，该培养基属于__________培养基。依用途划分，则属于__________培养基。(2)根据培养基原料，所培养微生物的同化作用类型是________________。(3)该培养基中的碳源是__________。不论何种培养基，在各成分都融化后分装前，要进行的是__________。(4)若用该培养基培养纤维素分解菌，应除去的物质是________________，应加入的物质是__________。(5)细菌种群进化过程中，起主要作用的变异是______。(填编号)A．环境条件 B．基因重组C．基因突变 D．染色体畸变20．请回答下列有关微生物培养基的问题：(1)微生物的培养都需要培养基，一般培养基都含有的成分有______________________；配制固体培养基还需要加入凝固剂________________。(2)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的一般流程包括：eq \x(计算)→eq \x(称量)→eq \x(融化)→A→B上述流程中A代表__________，实验室中这个步骤常用的方法有__________________；流程中B代表________________，该步骤进行的适宜温度是__________°C左右。(3)鉴定分解尿素的细菌的方法是向以______________为唯一氮源的培养基中加入__________指示剂，培养某种细菌，如果pH升高，指示剂将变红，说明该种细菌能分解尿素。(4)与全营养培养基中的菌落相比，选择培养基中菌落数( )A．多 B．少 C．相等 D．几乎为零21．某村庄有一条小溪，近几年由于上游几家乳胶厂不断向其中排放废水，小溪变得不再清澈。某同学想测定该溪水中的细菌含量情况。回答下列问题：(1)先根据所学知识制备LB培养基。制备该培养基的步骤是：计算→称量→融化→灭菌→倒平板。下列关于制备LB培养基的叙述，错误的是________。A．培养基应先调pH再进行灭菌B．培养基应先灭菌再分装到培养皿中C．融化琼脂时不能使培养基溢出或烧焦D．灭菌时一般用高压蒸汽灭菌锅在121 ℃，500 g/cm2 压力下灭菌15分钟(2)该同学利用上述制备的培养基来检测水样中的细菌数量，他所选择的分离方法应是____________；该同学在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是____________________________。接种在超净工作台上进行，实验前一段时间需打开工作台上的紫外灯和过滤风，实验中需关闭的是____________(A.酒精灯 B．照明灯 C．紫外灯 D．过滤风)。(3)值得注意的是，他所选择的这种方法统计的结果往往比实际细菌的数目要低，这是因为①__________________________；②_________________________________________________________________________________________________________________。(不考虑实验操作原因引起的细菌数目的变化)该同学欲将所分离出的某种细菌临时保藏，应接种到试管的____________培养基上，等菌落长成后，放入冰箱低温保藏。22．(2020·杭州模拟)从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验过程如图所示，请回答下列问题：eq \x(土样)―→eq \x(土壤浸出液)―→eq \x(稀释)―→eq \x(接种)―→eq \x(培养、观察)(1)欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，将土壤用________进行一系列的梯度稀释，同一浓度的土壤稀释液至少涂布________个平板。(2)在培养基中加入尿素(唯一氮源)，以分离出能分解尿素的细菌，这种加入尿素的培养基在功能上属于________。A．选择培养基 B．固体培养基C．液体培养基 D．半固体培养基(3)接种后的培养皿________放于37 ℃的恒温箱中培养。在能利用尿素的细菌菌落周围，有红色环带出现的原因是______________________________________________________________________________________________________________________________。(4)为了提高尿素肥效，可以将分解尿素的酶和尿素混合，制成“加酶尿素”。水培某植物时，为了提高“加酶尿素”中酶的利用率，可采用________技术。23．已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。回答下列问题：(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是________。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是________。(2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会________，其原因是__________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是________________________________________。(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供____________和______________________。24．(2020·宁波一模)某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如图所示。请分析回答下列问题：(1)培养基中加入化合物A的目的是____________________________，这种培养基属于______培养基。(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的________。实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是________。(3)在上述实验操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是______________________。(4)转为固体培养基时，常采用划线分离的方法进行接种，此过程中所用的接种工具是__________，操作时采用________灭菌的方法。25．急性肠胃炎、手足口病分别是由细菌和病毒通过消化道进入人体导致的，因此检验饮用水的细菌含量和病毒含量是有效监控疾病发生的必要措施。请回答下列与检验饮用水有关的问题：(1)在如图所示的四种菌落分布图中，不可能是用涂布分离法得到的是________。(2)图中用该方法得到的菌落分布图中，最符合计数要求的是图中的________。(3)用该方法统计样本菌落数时是否需要设置对照组？__________。为什么？________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)分别取0.1 mL、已稀释103倍的水样分别涂布到3个琼脂固体培养基的表面进行培养，培养基记录到大肠杆菌的菌落平均数为50。则每升原水样中大肠杆菌数为________。26．(2020·浙江教育绿色评价联盟高三考试)已知某细菌的两种突变类型细菌Ⅰ和细菌Ⅱ的营养条件和菌落特征都相同，但细菌Ⅰ能分解有机物A而不能分解有机物B，细菌Ⅱ能分解有机物B而不能分解有机物A。现有这两种类型细菌的混合液样品，要将其分离，有人设计了一种方案，部分操作步骤如下图。请回答下列问题：(1)步骤一使用的是____________培养基，其中含有细菌生长所需的水、无机盐、碳源和氮源等营养物质，此外还必须加入____________，以利于对不同菌种进行分离操作。(2)步骤一采用____________法接种，此接种法可使接种细菌逐渐稀释，经适宜条件培养，可形成单个、独立的____________，最终可能得到纯种的细菌；要进行上述接种操作，必须在____________及酒精灯火焰附近进行，以避免杂菌污染。(3)步骤三中，若对其中某瓶培养液中A、B两种有机物含量进行测定，当培养液中检测出如下的实验结果时，能说明培养液只有细菌Ⅰ的是________。A．化合物A与B含量都明显下降 B．化合物A含量明显下降，B含量基本不变C．化合物A含量基本不变，B含量明显下降 D．化合物A、B含量都基本不变27.回答下列关于微生物培养等问题：高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选了高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如图1所示。图1按功能分，Ⅰ号培养基称为________________；该培养基中必须添加的成分有________(多选)等。A.琼脂 B.葡萄糖 C.硝酸铵 D.淀粉(2) Ⅱ号培养基属于固体培养基，配制时一般应加入________作为凝固剂。一般对配制的培养基采用________________法灭菌，对接种环采用________灭菌，其中“灭菌”的含义是指______________________________________________。(3) 在高温淀粉酶运用到工业生产前，需对该酶的最佳温度范围进行测定。图2中的曲线①表示酶在各种温度下酶活性相对最高酶活性的百分比。将酶在不同温度下保温足够长的时间，再在酶活性最高的温度下测其残余酶活性，由此得到的数据为酶的热稳定性数据，即图2中的曲线②。图2① 根据图2中的数据，判断该酶使用的最佳温度范围是________。A.40～50 ℃ B.50～60 ℃ C.60～70 ℃ D.70～80 ℃② 据图2判断下列叙述错误的是________。A.该酶只能在最佳温度范围内测出活性 B.曲线②35 ℃数据点是在80 ℃时测得的C.曲线①表明80 ℃是该酶活性最高的温度D.曲线②表明该酶的热稳定性在70 ℃之后急剧下降28.在研究校园植物的选种时，某兴趣小组研究了校园植物凋落叶浸出液对土壤中固氮菌生长的影响。他们将a、b、c三种校园植物的落叶放入蒸馏水浸泡72 h，得到浸出液。取不同浸出液进行稀释后接种到选择培养基上，统计各组菌落数如表。回答下列问题：(1)本实验所用的选择培养基在物理性质上属于________培养基，在营养成分上与基本培养基的主要区别是________。本实验所用接种方法为________。(2)甲同学提出应留几个培养基不接种处理，你认为他这样做的目的是_____________。(3)乙同学根据实验结果推测土壤中固氮菌有多种，他的依据可能是________________。(4)本实验的结论是____________________________________________________________。29.酸雨主要是大气中所含的SO2造成的，利用微生物脱硫，具有工艺条件温和，成本低，还能脱出部分有机硫等优点。研究人员通过采集菌种，分离出目的菌后进行了如下操作，请回答下列相关问题：(1)为保证培养基上能均匀地生长出一层脱硫细菌，将菌液接种到固体培养基上时应采用____________(填“稀释涂布平板”或“平板划线”)法；操作过程中，与用于计数时的平板接种不同的是：本实验要保证滴加到培养基上的菌液______________________，以缩短培养时间。要对脱硫细菌进行长期保存，可采用________的方法在－20 ℃的冷冻箱中保存。(2)本实验过程中所使用的________技术，除了用来防止培养的脱硫细菌被其他外来微生物污染外，还能有效避免________被微生物(脱硫细菌)感染。(3)研究小组将四种含有等量抗菌药物的纸片贴在已接种脱硫细菌的琼脂平板上做药敏试验，在适宜的温度条件下培养16 h，结果如下图所示：根据上图的试验结果可知，对于脱硫细菌，抗生素Ⅰ的最低抑制浓度________(填“大于”“小于”或“等于”)抗生素Ⅲ。在相关试验操作均严谨规范的情况下，在含有抗生素Ⅳ的纸片周围出现了较大的抑菌圈，抑菌圈中存在有若干个脱硫细菌的菌落。试对上述现象的成因作出分析：_____________________________________________________________。 比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能牛奶稀释倍数102103104平板1菌落数/个87101平板2菌落数/个83121平板3菌落数/个85100成分含量蛋白胨10.0 g乳糖5.0 g蔗糖5.0 gK2HPO42.0 g显色剂(伊红美蓝)0.2 g琼脂12.0 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL加入糖类葡萄糖蔗糖淀粉麦芽糖空白对照降解率99%98%70%95%90%酪蛋白牛肉膏Na2HPO4NaCl琼脂蒸馏水10 g3 g2 g5 g15 g加至1 000 mL组别发酵条件谷氨酸棒状杆菌繁殖速率单个菌体产谷氨酸量第一组通入无菌空气、C/N＝3∶1较慢较多第二组通入无菌空气、C/N＝4∶1较快较少成分含量成分含量NaNO33 gFeSO40.01 gK2HPO41 gC6H12O630 g琼脂15 gH2O1 000 mLMgSO4·7H2O0.5 g青霉素0.1万单位组别12345678浸出液/mL(体积比)abca＋b(1∶1)a＋c(1∶1)b＋c(1∶1)a＋b＋c(1∶1∶1)－101010101010100蒸馏水/mL000000010菌落数19.3319.0023.0033.3341.0041.0050.003.67
专题15 微生物的培养与利用【要点提炼】 【方法指导】课题一 微生物的实验室培养·培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。·培养基按照物理性质可分为液体培养基 半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。液体培养基应用于工业或生活生产，固体培养基应用于微生物的分离和鉴定，半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。·按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。[来源:学科网]·按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。·培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 、生长因子等。·碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。·氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。·培养基还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件·无菌技术·获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。[来源:学科网ZXXK]③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。·消毒与灭菌的区别消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。灭菌方法： ①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法； ②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ； ③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。 ④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。制作牛肉膏蛋白胨固体培养基（1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。（2）倒平板操作的步骤：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。④等待平板冷却凝固，大约需5～10min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。·倒平板操作的讨论1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。纯化大肠杆菌（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。（5）平板划线法操作步骤：①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。③将试管口通过火焰。④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。⑧将平板倒置放入培养箱中培养。·平板划线操作的讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。（6）涂布平板操作的步骤：①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。②取少量菌液，滴加到培养基表面。③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s。④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布平板操作的讨论涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。菌种的保存（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。①临时保藏方法将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。疑难解答（1）生物的营养营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物质。[来源:学§科§网Z§X§X§K]人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。（2）确定培养基制作是否合格的方法将未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数尿素是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶。尿素最初是从人的尿液中发现的 筛选菌株（1）实验室中微生物的筛选应用的原理人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。（2）选择性培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数2.为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC 3.本法仅限于形成菌落的微生物设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。实验设计实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。（1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。（2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30到300之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用104 105 106测定放线菌的数量，一般选用103 104 105[来源:学科网ZXXK] 测定真菌的数量，一般选用102 103 104（3）微生物的培养与观察[来源:学#科#网Z#X#X#K]不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌30~37℃ 1~2天放线菌25~28℃ 5~7天 霉菌25~28℃ 3~4天每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、唯独及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。形状、大小、隆起程度、颜色。疑难解答（1）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值每克样品中的菌落数=（C/V）*M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数课题三 分解纤维素的微生物的分离纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。纤维素与纤维素酶（1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。（2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。纤维素分解菌的筛选（1）筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。分离分解纤维素的微生物的实验流程土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落（1）土壤采集 选择富含纤维素的环境。（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤 倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板（3）刚果红染色法种类一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。课题延伸对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后，只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。疑难解答（1）为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。（2）将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。（3）两种刚果红染色法的比较方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。（4）为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。【专题训练】1．下列有关细菌纯培养的说法，不正确的是 ( )A．实验操作者接种前需用70%的酒精棉球擦手消毒B．每次划线后接种环要在酒精灯火焰上灼烧灭菌C．培养基上的单个菌落都是一个细菌细胞的克隆D．菌液梯度稀释后用涂布法接种，得到单菌落便于计数2．某研究小组欲研究被石油污染过的土壤中细菌的数量，并从中筛选出能分解石油的细菌。下列操作错误的是( )A．称取和稀释被污染的土壤时应在火焰旁B．用以石油为唯一碳源的培养基进行筛选C．分离菌种时可采用稀释涂布平板法接种 D．对细菌进行计数时宜采用平板划线法接种3．如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为12345，下列说法中正确的是( )A．操作前要将接种环用酒精消毒 B．划线操作须在火焰上方进行C．只有在5区才可以得到所需菌落 D．在12345区域中划线前后都要对接种环灭菌4．在鉴别纤维素分解菌的培养基中，常常加入水溶性的羧甲基纤维素钠(CMC－Na)。下列叙述错误的是( )A．羧甲基纤维素钠(CMC－Na)主要为细菌提供氮源B．刚果红染液能与培养基中的纤维素形成红色复合物C．刚果红可在倒平板时加入，加入前需要将刚果红溶液灭菌D．纤维素酶至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶5．关于灭菌和消毒不正确的理解是( )A．灭菌是指杀灭环境中一切微生物的细胞、芽孢和孢子B．消毒和灭菌实质是相同的C．接种环用灼烧法灭菌 D．常用的消毒方法有加热法、过滤法、紫外线法、化学药品法6．牛奶中富含蛋白质，长期饮用有助于增强体质，但牛奶同时也是多种疾病的传播载体。国家标准是每毫升牛奶中细菌数小于30 000个。以下是牛奶消毒及细菌检测实验。分析回答：(1)图中步骤①称为____________消毒法。步骤②是_________。(2)培养基中的蛋白胨可以为微生物提供____________。进行步骤③操作时，应选用下列中的哪种工具？______________。为了避免杂菌污染，此步骤应在__________________附近进行。(3)将接种后的培养基和作为对照的________________同时放入37 ℃恒温培养箱中，培养36 h。取出后统计各平板的菌落数，结果如下表所示。应该选择其中稀释倍数为________________的平板进行计数，经过消毒后的牛奶中，细菌数大约是________个·mL－1。7．表格是某公司研发的一种培养大肠杆菌的培养基配方，请结合所学知识，回答下列相关问题。(1)根据用途划分，该培养基属于________培养基，若要分离能分解尿素的细菌，需对培养基做出的最关键的调整是____________，若还需鉴定分解尿素的细菌，需做出的调整是________________。(2)从培养基的成分上看，大肠杆菌的同化类型为________。该培养基能否分离筛选出大肠杆菌？为什么？___________________________________________________________。(3)在实验室培养微生物时，获得纯净培养物的关键是_______，紫外线可对空气进行灭菌的原因是_______________________________________________________________。(4)某同学尝试纯化大肠杆菌，其中一个平板的菌落分布如上图，推测该同学接种时可能的操作失误是___________________________________________________________。8．土壤中的苯酸(C6H5OH)对环境有极大的污染，实验室希望能从土壤中分离出能专一性降解苯酚的微生物，下图是部分实验过程。回答下列问题：(1)为了分离纯化目的菌种，①～④步骤的培养基中都加入了一定浓度的苯酚，该物质能为微生物提供________，除此而外，培养基中一般都还需要水、__________等营养物质。(2)制备步骤④所需要的固体培养基，操作顺序是：计算→称量→________→________→倒平板。为了在步骤⑤的平板上形成单个的菌落，涂布平板前，需要对培养液进行多次稀释，原因是_____________________________________________。(3)研究人员想通过比较试管甲和乙中微生物的生长情况，来证明分离出来的微生物只能以苯酚作为碳源，若甲试管中的液体培养基中的唯一碳源是苯酸，那么，乙试管中培养基成分与甲相比，区别是______________。研究人员对甲、乙两支试管进行接种时，所选菌种都来自步骤⑤平板上的同一个单菌落，这样做的目的是_______________________________。9．不同品牌的酸奶具有不同的口味。某研究小组利用含碳酸钙的固体培养基探究甲、乙两品牌酸奶中乳酸菌的类型是否相同(乳酸能够溶解碳酸钙，使培养基变得透明)。请回答下列问题：(1)将甲、乙两品牌酸奶中的乳酸菌纯化，分别接种在含碳酸钙的固体培养基中培养，根据菌落周围透明圈的大小，可确定酸奶中乳酸菌的类型。不同乳酸菌菌落透明圈大小不同的原因是________________________________________________________________________________________________________________________。(2)家庭制作酸奶时，在纯牛奶中加入少量酸奶相当于微生物培养技术中的________操作。纯牛奶变成酸奶，改变了口味但含有的能量减少，原因是_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)为长期保存纯化的优质乳酸菌，可将菌液与________充分混匀，置于20 ℃的冷冻箱中保存。(4)该研究小组进一步探究甲品牌酸奶中乳酸菌数量，实验操作如下图。接种微生物的方法有很多，图中过程①②③所示的方法为________。用该方法统计样本菌落数后，所得数据需要乘以10n后，才可表示乳酸菌的数量(单位：个/mL)，这里的n＝________。用该方法统计样本菌落数时，同时需要做A、B、C三个平板，目的是____________________________。如果平板菌落数超过300，一般还需进一步________。10．某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是_________________________________。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是__________________________(答出两点即可)。(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是________________。(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________________________(答出两点即可)。11．对硝基苯酚(PNP)颜色为黄色，若被分解则颜色消失，属于硝基苯酚类有机化合物的一种，主要来源于农药、医药、染料、塑料等生产企业排放，并广泛分布于环境中，对植物、微生物和动物均有毒性。某生物兴趣小组提出从污水厂曝气池长期驯化的污泥中分离出对硝基苯酚降解菌并研究其降解特性。回答下列问题：(1)分离对硝基苯酚降解菌的选择培养基成分有：NH4NO3、KH2PO4、K2HPO4、NaCl、FeSO4、MgSO4·7H2O、PNP和琼脂。试从成分分析该选择培养基能起到筛选作用的原因是__________________________________________________________________。(2)利用________(方法)分离纯化得到单一的对硝基苯酚降解菌菌落，可以将在菌落周围是否产生________作为筛选标记。(3)若分离纯化后得到了两个菌落，这两个菌落的形态、大小、光泽度、颜色等________(填“一定”或“不一定”)相同。(4)研究不同的糖类对PNP降解率的影响，得到的结果如表所示：从表中可得出的结论是___________________________________________________。12．凝乳酶是干酪和干酪素生产过程中的关键酶，动植物及微生物均能产生。由于微生物资源丰富，生长周期短，受气候等因素限制小等特点，微生物凝乳酶成为研究热点。为获得凝乳酶高产菌株，科研人员进行了以下分离、筛选、鉴定工作。培养基配方表：(1)从作用上看，该培养基属于________________(填“选择”或“鉴别”)培养基。(2)科研人员将牧区采集的土壤样品放入无菌水中，振荡混匀，制成悬液。为获得较均匀分布的单菌落，还需要将悬液进行________，用______法接种于上述培养基上。接种后的培养基以__________状态放入培养箱。(3)在涂布接种前，科研人员随机取若干灭菌后的空白平板先进行培养了一段时间，这样做的目的是________________________________________________________________________________。(4)在稀释倍数为106倍下涂布了三个平板(每次取0.1 mL)，统计菌落数分别为240、250、260，则稀释前1 mL菌液中所含此菌数量为________________。(5)挑选菌落时以白色沉淀圈大且透明圈小者为佳。将获得的菌株进行液体培养后，从培养液的________(填“上清液”或“沉淀物”)获得粗提的凝乳酶。将一定量的粗提凝乳酶与适量酪蛋白溶液混合，一定时间后测定吸光值来测定酶活性。进行吸光值测定值，需将________与等量酪蛋白溶液混合，作为实验的对照。13．某生物兴趣小组探究不同C/N的比值对谷氨酸棒状杆菌的数量和产物产生的影响，记录及其结果如下表。回答下列问题：(1)该兴趣小组进行实验时所用培养基除了能为谷氨酸棒状杆菌提供碳源和氮源外，还能提供的主要营养物质是________。(2)统计待测培养液中谷氨酸棒状杆菌的数量，可采用的方法有显微镜直接计数法和稀释涂布平板法。①利用显微镜直接计数法统计过程：取第二组的100倍的稀释液0.1 mL滴加到计数板(由25×16＝400个小室组成，容纳液体总体积为0.1 mm3)在计数室内共有菌体48个，则1 mL的第二组发酵液中有菌体________个。用该方法测定的微生物数量大于实际的活菌数，原因是__________________________________________________________________。②利用稀释涂布平板法统计的结果比实际值往往________(填“偏大”或“偏小”)，原因是_____________________________________________________。(3)根据表中信息可知，培养过程中需先将碳氮比设为4∶1，目的是________________________，然后将发酵液中碳氮比改为3∶1继续培养，目的是_____________________________________________________。14．回答下列与酵母菌有关的问题：(1)分离培养酵母菌通常使用____________(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基，该培养基应采用________灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后会观察到菌落，菌落的含义是______________。(2)酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进______________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)；若进行厌氧培养，可促进________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)。(3)制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是______________________。15．手机高温、潮湿的环境非常适合细菌的生长，由大肠杆菌引起的食源性疾病日渐成为社会比较关注的公共卫生问题。为了了解手机上大肠杆菌的种类及分布情况，某兴趣小组进行了如下实验步骤。请进一步完善实验内容并回答相关问题：(1)实验步骤：①配制含有________、水、无机盐的固体培养基，并在培养基中加入少量________(使大肠杆菌菌落呈现黑色)；②从10名学生的手机正、反面采集样品，分别接种至灭菌的培养基上，在37℃恒温培养箱中培养24～48h，选取________的菌落；③将接种针用________法灭菌后，将②中选取的菌落接种到________(填“固体”或“液体”)培养基，在恒温摇床上培养24h，使细菌大量繁殖；④用________法将③过程所获得的细菌接种到培养基上，分别统计菌落的种类和数目；⑤根据菌落的特征进一步鉴定大肠杆菌的类型。(2)上述实验步骤中，从用途看，①所用培养基属于________培养基。(3)上述实验步骤④统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是__________________________________。16．某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生______________________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是____________________________。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________________________________(答出两点即可)。(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是____________________________________。(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________(答出两点即可)。17．在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________。(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________，在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是____________________________。18．北方每年在小麦丰收的季节，焚烧秸秆火焰四起，烟雾弥漫，不但导致严重的雾霾而且造成资源的浪费。科学家为了解决这个问题，努力寻找分解秸秆中纤维素的微生物，他们做了如下实验，据图回答：eq \x(\a\al(从森林,里取土,壤样本))―→eq \x(\a\al(选择,培养))―→eq \x(\a\al(梯度,稀释))―→eq \x(\a\al(将样品接种到,鉴别纤维素分,解菌的培养基,上))―→eq \x(\a\al(挑选产生透明圈,的菌落，统计并,计算每克样品中,的细菌数)) 甲图(1)根据甲图，选择培养纤维素分解菌要用______________。为了鉴别纤维素分解菌，常在培养基中加入________。为了统计样品中活菌的数目，常用方法除稀释涂布平板法外，还有____________的方法。(2)乙图是培养出的单菌落示意图，最适合分解秸秆的两个菌落是______________(填数字)，纤维素分解菌将纤维素最终分解为________________。从图中可以看出培养基上菌落数较少，推测可能的原因是______________________________。(3)为了长期保存该微生物，可以采用________________的方法。19．如表为某微生物培养基的配方，请回答下列问题：(1)依物理性质，该培养基属于__________培养基。依用途划分，则属于__________培养基。(2)根据培养基原料，所培养微生物的同化作用类型是________________。(3)该培养基中的碳源是__________。不论何种培养基，在各成分都融化后分装前，要进行的是__________。(4)若用该培养基培养纤维素分解菌，应除去的物质是________________，应加入的物质是__________。(5)细菌种群进化过程中，起主要作用的变异是______。(填编号)A．环境条件 B．基因重组C．基因突变 D．染色体畸变20．请回答下列有关微生物培养基的问题：(1)微生物的培养都需要培养基，一般培养基都含有的成分有______________________；配制固体培养基还需要加入凝固剂________________。(2)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的一般流程包括：eq \x(计算)→eq \x(称量)→eq \x(融化)→A→B上述流程中A代表__________，实验室中这个步骤常用的方法有__________________；流程中B代表________________，该步骤进行的适宜温度是__________°C左右。(3)鉴定分解尿素的细菌的方法是向以______________为唯一氮源的培养基中加入__________指示剂，培养某种细菌，如果pH升高，指示剂将变红，说明该种细菌能分解尿素。(4)与全营养培养基中的菌落相比，选择培养基中菌落数( )A．多 B．少 C．相等 D．几乎为零21．某村庄有一条小溪，近几年由于上游几家乳胶厂不断向其中排放废水，小溪变得不再清澈。某同学想测定该溪水中的细菌含量情况。回答下列问题：(1)先根据所学知识制备LB培养基。制备该培养基的步骤是：计算→称量→融化→灭菌→倒平板。下列关于制备LB培养基的叙述，错误的是________。A．培养基应先调pH再进行灭菌B．培养基应先灭菌再分装到培养皿中C．融化琼脂时不能使培养基溢出或烧焦D．灭菌时一般用高压蒸汽灭菌锅在121 ℃，500 g/cm2 压力下灭菌15分钟(2)该同学利用上述制备的培养基来检测水样中的细菌数量，他所选择的分离方法应是____________；该同学在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是____________________________。接种在超净工作台上进行，实验前一段时间需打开工作台上的紫外灯和过滤风，实验中需关闭的是____________(A.酒精灯 B．照明灯 C．紫外灯 D．过滤风)。(3)值得注意的是，他所选择的这种方法统计的结果往往比实际细菌的数目要低，这是因为①__________________________；②_________________________________________________________________________________________________________________。(不考虑实验操作原因引起的细菌数目的变化)该同学欲将所分离出的某种细菌临时保藏，应接种到试管的____________培养基上，等菌落长成后，放入冰箱低温保藏。22．(2020·杭州模拟)从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验过程如图所示，请回答下列问题：eq \x(土样)―→eq \x(土壤浸出液)―→eq \x(稀释)―→eq \x(接种)―→eq \x(培养、观察)(1)欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，将土壤用________进行一系列的梯度稀释，同一浓度的土壤稀释液至少涂布________个平板。(2)在培养基中加入尿素(唯一氮源)，以分离出能分解尿素的细菌，这种加入尿素的培养基在功能上属于________。A．选择培养基 B．固体培养基C．液体培养基 D．半固体培养基(3)接种后的培养皿________放于37 ℃的恒温箱中培养。在能利用尿素的细菌菌落周围，有红色环带出现的原因是______________________________________________________________________________________________________________________________。(4)为了提高尿素肥效，可以将分解尿素的酶和尿素混合，制成“加酶尿素”。水培某植物时，为了提高“加酶尿素”中酶的利用率，可采用________技术。23．已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。回答下列问题：(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是________。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是________。(2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会________，其原因是__________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是________________________________________。(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供____________和______________________。24．(2020·宁波一模)某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如图所示。请分析回答下列问题：(1)培养基中加入化合物A的目的是____________________________，这种培养基属于______培养基。(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的________。实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是________。(3)在上述实验操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是______________________。(4)转为固体培养基时，常采用划线分离的方法进行接种，此过程中所用的接种工具是__________，操作时采用________灭菌的方法。25．急性肠胃炎、手足口病分别是由细菌和病毒通过消化道进入人体导致的，因此检验饮用水的细菌含量和病毒含量是有效监控疾病发生的必要措施。请回答下列与检验饮用水有关的问题：(1)在如图所示的四种菌落分布图中，不可能是用涂布分离法得到的是________。(2)图中用该方法得到的菌落分布图中，最符合计数要求的是图中的________。(3)用该方法统计样本菌落数时是否需要设置对照组？__________。为什么？________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)分别取0.1 mL、已稀释103倍的水样分别涂布到3个琼脂固体培养基的表面进行培养，培养基记录到大肠杆菌的菌落平均数为50。则每升原水样中大肠杆菌数为________。26．(2020·浙江教育绿色评价联盟高三考试)已知某细菌的两种突变类型细菌Ⅰ和细菌Ⅱ的营养条件和菌落特征都相同，但细菌Ⅰ能分解有机物A而不能分解有机物B，细菌Ⅱ能分解有机物B而不能分解有机物A。现有这两种类型细菌的混合液样品，要将其分离，有人设计了一种方案，部分操作步骤如下图。请回答下列问题：(1)步骤一使用的是____________培养基，其中含有细菌生长所需的水、无机盐、碳源和氮源等营养物质，此外还必须加入____________，以利于对不同菌种进行分离操作。(2)步骤一采用____________法接种，此接种法可使接种细菌逐渐稀释，经适宜条件培养，可形成单个、独立的____________，最终可能得到纯种的细菌；要进行上述接种操作，必须在____________及酒精灯火焰附近进行，以避免杂菌污染。(3)步骤三中，若对其中某瓶培养液中A、B两种有机物含量进行测定，当培养液中检测出如下的实验结果时，能说明培养液只有细菌Ⅰ的是________。A．化合物A与B含量都明显下降 B．化合物A含量明显下降，B含量基本不变C．化合物A含量基本不变，B含量明显下降 D．化合物A、B含量都基本不变27.回答下列关于微生物培养等问题：高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选了高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如图1所示。图1按功能分，Ⅰ号培养基称为________________；该培养基中必须添加的成分有________(多选)等。A.琼脂 B.葡萄糖 C.硝酸铵 D.淀粉(2) Ⅱ号培养基属于固体培养基，配制时一般应加入________作为凝固剂。一般对配制的培养基采用________________法灭菌，对接种环采用________灭菌，其中“灭菌”的含义是指______________________________________________。(3) 在高温淀粉酶运用到工业生产前，需对该酶的最佳温度范围进行测定。图2中的曲线①表示酶在各种温度下酶活性相对最高酶活性的百分比。将酶在不同温度下保温足够长的时间，再在酶活性最高的温度下测其残余酶活性，由此得到的数据为酶的热稳定性数据，即图2中的曲线②。图2① 根据图2中的数据，判断该酶使用的最佳温度范围是________。A.40～50 ℃ B.50～60 ℃ C.60～70 ℃ D.70～80 ℃② 据图2判断下列叙述错误的是________。A.该酶只能在最佳温度范围内测出活性 B.曲线②35 ℃数据点是在80 ℃时测得的C.曲线①表明80 ℃是该酶活性最高的温度D.曲线②表明该酶的热稳定性在70 ℃之后急剧下降28.在研究校园植物的选种时，某兴趣小组研究了校园植物凋落叶浸出液对土壤中固氮菌生长的影响。他们将a、b、c三种校园植物的落叶放入蒸馏水浸泡72 h，得到浸出液。取不同浸出液进行稀释后接种到选择培养基上，统计各组菌落数如表。回答下列问题：(1)本实验所用的选择培养基在物理性质上属于________培养基，在营养成分上与基本培养基的主要区别是________。本实验所用接种方法为________。(2)甲同学提出应留几个培养基不接种处理，你认为他这样做的目的是_____________。(3)乙同学根据实验结果推测土壤中固氮菌有多种，他的依据可能是________________。(4)本实验的结论是____________________________________________________________。29.酸雨主要是大气中所含的SO2造成的，利用微生物脱硫，具有工艺条件温和，成本低，还能脱出部分有机硫等优点。研究人员通过采集菌种，分离出目的菌后进行了如下操作，请回答下列相关问题：(1)为保证培养基上能均匀地生长出一层脱硫细菌，将菌液接种到固体培养基上时应采用____________(填“稀释涂布平板”或“平板划线”)法；操作过程中，与用于计数时的平板接种不同的是：本实验要保证滴加到培养基上的菌液______________________，以缩短培养时间。要对脱硫细菌进行长期保存，可采用________的方法在－20 ℃的冷冻箱中保存。(2)本实验过程中所使用的________技术，除了用来防止培养的脱硫细菌被其他外来微生物污染外，还能有效避免________被微生物(脱硫细菌)感染。(3)研究小组将四种含有等量抗菌药物的纸片贴在已接种脱硫细菌的琼脂平板上做药敏试验，在适宜的温度条件下培养16 h，结果如下图所示：根据上图的试验结果可知，对于脱硫细菌，抗生素Ⅰ的最低抑制浓度________(填“大于”“小于”或“等于”)抗生素Ⅲ。在相关试验操作均严谨规范的情况下，在含有抗生素Ⅳ的纸片周围出现了较大的抑菌圈，抑菌圈中存在有若干个脱硫细菌的菌落。试对上述现象的成因作出分析：_____________________________________________________________。 比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能牛奶稀释倍数102103104平板1菌落数/个87101平板2菌落数/个83121平板3菌落数/个85100成分含量蛋白胨10.0 g乳糖5.0 g蔗糖5.0 gK2HPO42.0 g显色剂(伊红美蓝)0.2 g琼脂12.0 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL加入糖类葡萄糖蔗糖淀粉麦芽糖空白对照降解率99%98%70%95%90%酪蛋白牛肉膏Na2HPO4NaCl琼脂蒸馏水10 g3 g2 g5 g15 g加至1 000 mL组别发酵条件谷氨酸棒状杆菌繁殖速率单个菌体产谷氨酸量第一组通入无菌空气、C/N＝3∶1较慢较多第二组通入无菌空气、C/N＝4∶1较快较少成分含量成分含量NaNO33 gFeSO40.01 gK2HPO41 gC6H12O630 g琼脂15 gH2O1 000 mLMgSO4·7H2O0.5 g青霉素0.1万单位组别12345678浸出液/mL(体积比)abca＋b(1∶1)a＋c(1∶1)b＋c(1∶1)a＋b＋c(1∶1∶1)－101010101010100蒸馏水/mL000000010菌落数19.3319.0023.0033.3341.0041.0050.003.67
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